新颖肿瘤标志物GW112在胃癌及结直肠癌等消化道-上海胸科医院

GW112在食管鳞癌中的表达研究ExpressionofGW112inesophagealsquamouscellcarcinoma1汪令伟 王林目的：检测新颖肿瘤标志物GW112基因在食管鳞癌中的表达情况，以期促进对食管鳞癌的肿瘤标志物的研究。方法：用免疫组织化学法检测对70例食管癌组织和正常食管组织中的GW112蛋白表达；TaqMan探针荧光定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR)方法检测26例食管鳞癌及正常食管组织中GW112基因的mRNA的表达水平；对获得的实验数据结合标本的临床资料进行统计学分析。结果：TaqMan探针荧光定量PCR和免疫组化结果表明，在正常食管组织中无GW112基因的表达；GW112基因在食管鳞癌组织中表达水平上调；GW112基因表达与年龄、临床TNM分期、肿瘤分化程度以及淋巴结转移情况相关，并且在高龄、临床TNM中晚期、中低分化以及存在淋巴结转移的食管鳞癌组织中GW112基因的表达上调更为明显。结论：抗凋亡基因GW112在食管鳞癌中表达上调，食管鳞状细胞癌的发生发展中显然GW112基因表达水平的上调起着重要的作用。1作者单位：116021辽宁省大连市沙河口区万岁街 156号 大连大学附属新华医院通信作者：王林， Email：wanglinbox@简介：王林，男，主任医师，医学博士，教授，硕士生导师 .汪令伟，男，硕士研究生 .汪令伟：电话：mail：416758600@基金项目：辽宁省大连市科技计划项目 (2012E15SF147)Abstract】Objective:GW112(alsocalledolfm4andhGC-1)isagastrointestinalproteinthatisamemberoftheolfactomedinglycoproteinfamily.AberrantexpressionofGW112insomehumancarcinomashasbeenrecentlyreported,especiallyingastriccarcinomaandColonCarcinoma.ThepurposeofthisstudywastoexamineGW112expressioninesophagealsquamouscellcarcinomaandexploretherelationshipbetweenGW112expressionandtheclinicopathologicfeaturesofpatientswithesophagealsquamouscellcarcinoma(ESCC).Methods:TheexpressionofGW112inesophagealsquamouscellcarcinomatissueswasexaminedbyreal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction(Real-timePCR)andimmunohistochemistry.TheassociationofGW112expressionpatternwithpatientdifferentiationgrade,tumorstage,ageandLymphnodemetastasiswereexamined.Results:ComparedwithnormalEsophagealtissue,theup-regulationofGW112wasmorefrequentlydetectedinesophagealsquamouscellcarcinoma.Interestingly,GW112up-regulationwasalsomorefrequentlyfoundinold,poorlydifferentiation,advancedandlymphnode-metastasisstage.Conclution:OurstudyindicatethattheexpressionGW112isassociatedwitholdpeople,advancedstge,poorlydifferentiationandlymphnodemetastasisofesophagealsquamouscellcarcinoma,anditmayplaysanimportantroleinthedevelopmentofesophagealsquamouscellcarcinoma.关键词：GW112、食管鳞癌、免疫组织化学、TaqMan探针荧光定量PCRQRT-PCR）Key Words：GW112, esophagealsquamouscell carcinoma,immunohistochemistry,TaqMan probefluorescencequantitativePCR（QRT-PCR）食道癌（ESC），包括鳞状细胞癌（ SCC）和腺癌被认为是在绝大多数情况下预后差、死亡率高的恶性肿瘤 [1,2] 。食管癌在全世界发病已超过450000人，并且全球发病率正在迅速增加[3]。目前，食管癌因为其具有易侵袭性和存活率差的特性，位居全球最常见的癌症第八位[4,5] 。GW112(又名OLFM4，HGC-1)是近年来发现的与多种肿瘤细胞凋亡、周期调控相关的功能性基因。GW112最初被克隆于人的原始粒细胞，位于人类 13q14.3染色体[6]，邻近抑癌因子 Rb基因，可编码510个氨基酸[7]，其蛋白质产物为OLFM4的前体，属于嗅觉介导素olfactomedin相关蛋白家族的一员[8]。GW112与其他基因较少同源，对其结构及功能的研究所得较少。Zhang等研究发现GW112具有抗细胞凋亡的作用[9]，而抗细胞凋亡恰恰是大多数或者全部肿瘤的共同特点[10]。然而，GW112基因在食管鳞癌中的研究现状是不确切的，很少有结果报告。因此本课题采用免疫组化、 TaqMan探针荧光定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR)的方法针对GW112基因在食管鳞癌及正常食管中的表达情况进行了初步研究，调查 GW112基因在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中的所起到的作用， 以期寻找的新颖有效的针对食管鳞癌的分子标记物。实验对象和方法1.1实验对象选取2010年5月到2013年5月在大连大学附属中山医院及大连医科大学附属第一医院、大连市中心医院、中国医科大学附属第一医院胸外科住院手术治疗的70例病人。其中男63例，女7例，年龄?80岁之间。所有标本留取前均经医院伦理委员会批准，并在每一个标本采集前由患者家属签署知情同意书。1.2实验方法1.2.1 组化染色SP法:采用免疫组化 SP法, 试验方法按照说明书操作, 所需试剂均由北京义翘神州有限公司提供。1.2.2.RNA的提取：应用Life Technologies 公司PURELINKRNAMINIKIT（RNA抽提试剂盒），按说明书要求提取 RNA，并用NanoDropND1000

紫外分光光度计测定含量和纯度。所提取的总

RNA一律冻存于-80℃冰箱中待用。1.2.3.cDNA

的合成：应用

LifeTechnologies

公司用于

qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统，于冰上在微量离心管中加入

1μg

总RNA，Oligo（dt）20、10mMdNTP混合物、灭菌蒸馏用水，配成总 13μl混合物，混合物在 65℃加热5分钟后，迅速置于冰上短暂冷却。冷却后短暂离心，加入 5x第一链合成缓冲液 4μl 、0.1MDTT2μl，于离心管中轻轻将各组分混合均匀， 37℃水浴孵育2分钟，再于室温下加入M-MLV逆转录酶1μl，轻轻地吹打混匀，37℃水浴孵育50分钟，70℃水浴加热15分钟以终止反应。经此合成所得cDNA全部冻存于-80℃冰箱以备用。1.2.4.引物设计及合成：以NCBIGenBank中提供的GW112人类基因序列(表1)行引物设计，并由LifeTechnologies公司合成。以管家基因β-actin作为内参基因。表1基因名称 正向（5’—3’） 反向（3’—5’）GW112 ATGAGAATGGATTGTGGGTT GAAGGGGTTAGAAGGAGAβ-actin ATTCGTGCGTGACATTAAGGAGAATGGGGAGAAATTCGGCTGTG1.2.5.TaqMan 荧光定量PCR：采用LifeTechnologies 公司TaqManGeneExpression Assays试剂盒，在 20μL反应体系中加入TaqMan?UniversalMasterMixII，noUNG（2x）10μL，TaqMan?Assay20x）1μL，cDNA100ng，用RNase-freewater将总反应体积调至20μL。置于日盛荧光定量 PCR仪中按下述反应条件进行扩增。反应条件为：50℃2min1个循环，然后95℃10min1个循环，95℃15s、60℃1min 共40个循环。2统计学分析：使用SPSS13.0统计软件进行数据分析。检测结果以±S表示。两独立样本t检验对癌组织组和癌旁正常组织组两组间差异进行比较。TNM分期组间差异应用多样本秩和分析进行比较。P<0.05认为有统计学意义。结果3.1.免疫组化：高龄、进展期、中低分化、发生淋巴结转移的食管鳞癌患者中GW112的染色常呈阳性（Table2）；中晚期的食管鳞癌组织中染色呈强阳性（Table1-A）；早期的食管鳞癌组织中染色呈弱阳性（Table1-B）；正常食管组织中染色呈阴性（Table1-C）。免疫组化判定标准综合染色强度及阳性细胞所占百分比进行平均半定量处理。染色强度评分标准分4个等级：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比分5个等级，阳性细胞数<5%为0分，5%~25%为1分，25%~50%为2分，50%~75%为3分，>75%为4分。两种评分相乘：0分为（—），1~3分为（+），4~8分为（++）9~12分为（+++）。把（—~+）作为“阴性”，（++~+++）作为“阳性”进行处理。A BCTab1TheexpressionoftheGW112proteinindifferentiationgrade,tumorstageofesophagealsquamouscellcarcinomaandnorma.3.2.GW112在正常食管组织中不表达，而在食管鳞癌组织中基因表达上调（如 Fig2）。并且在高龄、进展期、中低分化、发生淋巴结转移的食管鳞癌患者中 GW112mRNA表达水平上调更加明显（ Table2）。a.b.Fig2 TheexpressionofGW112intheNormalesophagealtissueandESSCFig.2AmplificationcurveGW112(a)andβ-actin(b).OverexpressionofGW112wasobservedinESCCtissue,whereasabsentexpressionwasassociatedwithnormaltissue(datanotshown).Table2. 免疫组化显示GW112蛋白在食管鳞癌组织中的表达情况及与临床病理资料的关系(no.ofsamples) + +/- - P*性别男,63291321女,7214无意义年龄(范围,43-80岁)43-60(34)4102061-80(36)2745P<0.05分化程度高分化=165110中分化=3014124低分化=2412111P均<0.05TNM分期I+II=3915132III+IV=3116114P<0.05其中淋巴结转移病例总计=442789P<0.05NOTE:GW112expressioninesophagealsquamouscellcarcinomatissueswasdetectedbyimmunohistochemistry.+,strongstaining;+/-,moderatestaining;-,weakorabsentstaining.*Pvaluesarebasedonacomparisonofthevaluereportedunder(-)columnwiththevalueunderthe(+)column.讨论中国是食管鳞状细胞癌的高发区，老年人群、男性比女性发病率较高。患者主要表现为进行性的吞咽困难，其发病机制可能与食道粘膜所受的长期慢性的刺激、长期食用霉变的或含有亚硝胺类化合物的食物、微量元素的缺乏、食道本身慢性病变和遗传等因素相关。在食管癌的回顾性研究中，吸烟、热茶热饮，食用红肉，不良的口腔卫生，新鲜水果和蔬菜摄入量低，社会经济地位低的人群发生食管鳞状细胞癌的风险较高[11]。因食管鳞癌患者通常早期无症状，发现时多属中晚期，食管鳞癌发生淋巴结转移较早，5年生存率较低，因此早期诊断和早期治疗是提高患者生存率的有效方法。肿瘤标志物是常用的肿瘤早期诊断的分子指标，但目前针对食管鳞癌的肿瘤标志物特异性不明显。GW112是近年来首先从白血病中发现的抑制肿瘤细胞凋亡的功能性基因, 其蛋白产物为 olfactomedin4 的前体，属于 olfactomedin相关蛋白家族。在人类的多种肿瘤尤其是胃、 结直肠等消化系统肿瘤中特异表达，其表达情况与肿瘤的恶性程度及侵袭转移密切相关。2001年Shinozaki发现GW112基因表达于溃疡性结肠炎的炎性黏膜中，随后Zhang等在体外实验研究发现GW112具有抗细胞凋亡的作用，而抗细胞凋亡是大部分或者全部肿瘤的共同特点。GW112还参与NOD1和NOD2介导的NF-κB信号传导途径的激活[12]，NF-κB通过对凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达的调节作用,以及与肿瘤抑制蛋白(如p53)的直接作用实现抗凋亡功能； NF-κB所介导的对自我吞噬作用的抑制效应,是其发挥抗凋亡作用的新机制 [13]。现有研究表明,NF-κB通过对基因的转录调节 ,促进肿瘤发生、肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[14,15]。GW112可结合凋亡启动分子 GRIM19，抑制GRIM19功能，发挥促进肿瘤细胞生长、抑制细胞凋亡的作用。GW112

通过延长肿瘤细胞

S期促进肿瘤细胞的增殖

[16]

。GW112基因的过度表达导致细胞形态和肌动蛋白细胞骨架发生改变

[6]。钙粘素表达降低与肿瘤的分化、侵袭和转移有显著的相关性

[17]

。细胞外基质中的GW112可以弥合细胞间的连环素，并有助于连接细胞和细胞基质[18,19]。上皮源性肿瘤 E-钙粘素表达的减弱表明肿瘤进展 [20]。因此GW112通过与细胞外粘附分子——钙粘素及其连环素相结合来调控肿瘤细胞的扩散和粘附[21]，从而参与肿瘤浸润和转移。在我们的实验中，免疫组化及 TaqMan探针荧光定量反转录聚合酶连反应（QRT-PCR)的方法被用来研究 GW112在食管鳞癌组织及正常食管组织中的表达。我们的研究发现， GW112在正常食管组织中不表达，其在食管鳞癌组织中的表达水平高于正常食管组织的表达水平。GW112基因在中晚期食管鳞癌组织中（临床 TNM分期中的III~IV 期）中比在早期（临床 TNM分期中的I~II 期）表达水平上调更加明显（P<0.01）；相比之下，GW112在高龄、中低分化、有淋巴结转移组的表达水平对比年轻、高分化、无淋巴结转移组的更加明显（P<0.01）。表明GW112基因的表达水平与患者年龄、 临床TNM分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移的情况存在相关性。综上所述，免疫组化及 TaqMan探针荧光定量（QRT-PCR）检测发现对比正常食管组织， GW112基因在食管鳞癌组织中表达水平上调。在与肿瘤临床数据相关的研究中发现，GW112基因的表达水平与年龄、临床TNM分期、肿瘤的分化程度以及有无淋巴结转移存在相关性。GW112在高龄、临床TNM分期中晚期、中低分化、有淋巴结转移组表达水平上调更为明显。但是，GW112在食管腺癌及Barrett 食管中的表达情况仍不明确，与食管鳞癌患者预后生存的相关性的研究由于标本取材时间的关系尚未开展，因此，下一步将是对GW112在食管腺癌和Barrett 食管中的表达，以及与食管鳞状细胞癌预后情况的研究。参考文献Retraction:ThecandidatetumorsuppressorgeneECRG4inhibitscancercellsmigrationandinvasioninesophagealcarcinoma[J].JExpClinCancerRes2011;30:19Esophagealcancer:epidemiology,pathogenesisandprevention[J].NatClinPractGastroenterolHepatol2008;5:517-526PennathurA,GibsonMK,JobeBA,LuketichJD.Oesophagealcarcinoma[J].Lancet2013;381:400-412MaoWM,ZhengWH,LingZQ.Epidemiologicriskfactorsforesophagealcancerdevelopment[J].AsianPacJCancerPrev2011;12:2461-2466EnzingerPC,MayerRJ.Esophagealcancer[J].NEnglJMed2003;349:2241-2252LiuW，LiuY，ZhuJ，etal.ReducedhGC-1proteinexpressionisassociatedwithmalignantprogressionofcoloncarcinoma[J].ClinCancerRes，2008，14(4):1041-1049.J.Zhang,W.L.Liu,D.C.Tang,etal.Identificationandcharacterizationofanovelmemberofolfactomedin-relatedproteinfamily,hGC-1,expressedduringmyeloidlineagedevelopment[J].Gene,2002,283(1-2):83–93.TomarevSI,NakayaN.Olfactomedindomain-containingproteins:Possiblemechanismsofactionandfunctionsinnormaldevelopmentandpathology[J].MolNeurobiol,2009,40(2):122–138.ZhangX,HuangQ,YangZ,etal.GW112,anovelantiapoptoticproteinthatpromotestumorgrowth[J].CancerRes,2004,64(7):2474-2481.NaohideOue,KazuhiroSentani,TsuyoshiNoguchi,etal.Serumolfactomedin4(GW112,hGC-1)incombinationwithRegIVisahighlysensitivebiomarkerforgastriccancerpatients[J].Int.J.Cancer,2009,125:2383–2392.YuweiZhang.Epidemiologyofesophagealcancer.WorldJGastroenterol2013September14;19(34):5598-5606WenliLiu,MingYan,YueqinLiu,etal.Olfactomedin4down-regulatesinnateimmunityagainstHelicobacterpyloriinfection[J].PNAS,2010,107(24):11056-11061.[13]Djavaheri-MergnyM,AmelottiM,MathieuJ,etal.NF–kappaBactivationrepressestumornecrosisfactor-alpha-inducedautophagy[J].JBiolChem,2006,281(41):30373-30382.HagemannT,WilsonJ,KulbeH,etal.MacrophagesinduceinvasivenessofepithelialcancercellsviaNF-kappaBandJNK[J].JImmunol,2005,75(2):1197-1205.[