怎样用好液相色谱详解

怎样用好液相色谱详解演示文稿当前1页，总共118页。优选怎样用好液相色谱当前2页，总共118页。液相色谱仪的使用正确连接液相色谱仪系统可使用户受益，原因如下：

相对比较便宜不需要花费大量的时间系统中大多数流体连接均易于检修通常有助于避免不必要的硬件替换接头对正确连接至关重要，因此知道接头的一些基本特点也很重要。液相色谱仪的正确连接当前3页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接接头的普通特征

螺纹（10-32，¼-28，M6x1）管道外径（1/16”、1/32”、1/8”）端口几何形状（锥形、平底）管套直径接头要素当前4页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接套圈固定管道，并且始终以相同方式固定——用力按入圆锥形端口，如下图所示……套圈锥度（或角度）端口锥度（或角度）接头要素当前5页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接…然后在套圈接触内套处压紧管壁。接头要素当前6页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接通用端口有以下特征：螺纹管道尺寸内部几何形状…但并非所有的接头都是通用的!接头要素当前7页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接接头要素管套的深度并非通用!即使是最好的接头，如果不正确使用也会产生许多问题。为什么会出现问题？当前8页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接接头要素以下示例解释了不匹配的接头导致多种色谱法问题的原因：如果前端太长，套圈不能密封——因而会发生泄漏……如果前端太短，套圈可以密封——但是将会导致无效空间（死体积）和混合的发生……当前9页，总共118页。液相色谱仪的使用接头要素液相色谱仪的正确连接连接出现泄漏后将会引发以下问题：系统压力损失注射假象（鬼峰）出现混合室（死体积）将会引发以下问题：色谱峰加宽分辨率减低显著残留裂峰引发色谱法问题的原因很多时，接头不匹配或使用不当将可能导致液相色谱仪的所有主要问题发生!当前10页，总共118页。液相色谱仪的使用接头要素液相色谱仪的正确连接选择匹配的接头时，应首先清楚以下问题：使用的端口螺纹类型（例如，10-32、¼-28等。）使用的端口几何尺寸（例如，锥形或平底）所需连接的管道外径（例如，1/16”，1/8”）是否可以手动紧固连接接头应与哪些化学药品兼容接头应该承受多大压力当前11页，总共118页。液相色谱仪的使用管道要素液相色谱仪的正确连接关于液相色谱仪中的管道，以下三个要素必须考虑：管道的正确型号管道的最有效尺寸切割管道的合适工具如果想获取最好的色谱法效果，必须考虑这三个方面！当前12页，总共118页。液相色谱仪的使用管道要素液相色谱仪的正确连接如果您想选择适合应用需要的管道类型，请考虑以下问题：管道在系统中的使用位置哪种管道材料能够实现最好的兼容性产生多少压力可提供多种不同类型的管道……高压管道：不锈钢、PEEK™、Radel®R、PEEKsil™等。低压管道:Teflon®FEP、Teflon®PFA、Tefzel®等。当前13页，总共118页。液相色谱仪的使用管道要素液相色谱仪的正确连接选择合适的管道尺寸时，请考虑以下问题：接受端口需要什么尺寸的管道？流速多少？管道将会产生多大压力？接头提供的管道尺寸是多少？请始终注意……-高压管道最常见的尺寸为：1/16”ODx.010”ID-低压管道最常见的尺寸为：1/8”ODx1/16”ID当前14页，总共118页。液相色谱仪的使用管道要素液相色谱仪的正确连接这是系统低压、高流量区域。这是系统高压、低流量区域。这是系统低压、低流量区域。当前15页，总共118页。液相色谱仪的使用管道要素液相色谱仪的正确连接在具体应用中，仅仅选择合适的管道类型和正确的管道尺寸还远远不够，但是………如果管道切割不当，那么结果可能仍不理想。当前16页，总共118页。液相色谱仪的使用管道要素液相色谱仪的正确连接正确的切割技术确实能影响色谱法的质量……不正确切割 正确切割当前17页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接储液器和泵之间的管道连接管道通常用Teflon®材料制造，尺寸为1/8”ODx1/16”ID。将管道连接至泵上的接头通常为¼-28螺纹，平底几何形状。泵和检测器之间的管道连接管道通常用PEEK™聚合体或不锈钢材料制造，尺寸为：1/16”ODx.010”ID或稍小。将管道连接至系统部件上的接头通常为10-32螺纹，锥形几何形状。检测器之后的管道连接管道通常用Teflon®材料制造，尺寸为1/16”OD选择正确接头和管道的一般准则当前18页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接管道内径的公英制换算内径体积内径体积英寸mmuL/cm英寸mmuL/cm0.0050.130.130.030.754.560.0070.180.250.041.008.110.010.250.510.0461.2010.720.020.52.03当前19页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接HPLC系统不同部位的管道部位种类内径/mm长说明储液器～泵聚四氟乙烯1.6随意能透氧泵～进样器不锈钢管0.25~0.5随意进样器定量管不锈钢或PEEK视定量管体积而定长短由进样体积定，一般由进样阀制造商提供进样器～柱不锈钢管0.18~0.25尽量短柱～检测器不锈钢或PEEK0.18~0.25尽量短检测器放空聚四氟乙烯或聚乙烯0.25随意需要时加长到1米，增加流过池出口压力当前20页，总共118页。液相色谱仪的使用液相色谱仪的正确连接不同色谱柱的管道使用指南色谱柱/(1mL/min)不同内径(mm)管柱外峰宽效应5％时最大长度/cm柱长(mm)内径(mm)填料粒度um塔板数0.18mm0.25mm0.5mm334.634400229＜8504.6366773314＜81004.63133336727＜81504.651200016768＜82504.6520000278114＜82502.05200005020＜82501.052000012＜8＜8当前21页，总共118页。液相色谱分析分析型液相色谱仪定性及定量分析

a.灵敏度的要求b.样品的复杂性c.样品量的要求d.精度及准确度的要求e.容易使用当前22页，总共118页。液相色谱分析分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分之的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基团反相色谱固定相多为键合相当前23页，总共118页。液相色谱分析键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点：固定相稳定，不易流失。应用广泛，可使用多种溶剂。消除硅羟基的不良影响。缺点：PH值不能小于3或大于8同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同。当前24页，总共118页。液相色谱分析色谱柱化学及外形的关系当前25页，总共118页。液相色谱分析Q：需要什么样的分离结果？A：分辨率高。当前26页，总共118页。液相色谱分析什么是色谱的分辨率？分辨率R的公式：当前27页，总共118页。液相色谱分析影响分辨率的因素：k’，a，N分辨率的方程：k’是容量因子，表达了样品与填料的作用强弱。a是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度，是化学因素。N是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。当前28页，总共118页。液相色谱分析色谱柱的柱效N理论塔板数计算公式：当前29页，总共118页。液相色谱分析提高柱效(N)的方法色谱柱本身减小填料的颗粒度找到最佳的流速（根据不同的内径）合适的温度降低溶剂的粘度增加柱长当前30页，总共118页。液相色谱分析其他影响柱效(N)的因素柱外效应连接管路进样器检测器进样体积样品浓度当前31页，总共118页。液相色谱分析容量因子k’与峰高的关系与R的关系改变k’值的方法：调节流动相中有机溶剂浓度、pH值、离子强度等梯度淋洗k’=(tR-t0)/t0当前32页，总共118页。液相色谱分析选择性系数a定义：a＝1时两组分分不开，改变a的途径：改变流动相种类改变固定相改变温度改变样品的本身性质当前33页，总共118页。液相色谱分析a、k’、N如何控制分辨率

原始分离状态改变k’后改变a后改变N后当前34页，总共118页。液相色谱分析开发液相色谱分析方法分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下因素都要考虑。1.灵敏度5.成本2.载样量6.容易使用3.分析速度7.色谱柱寿命4.溶剂消耗8.效率当前35页，总共118页。液相色谱分析液相色谱分析方法的建立1建立液相色谱分析方法通常有以下几步：（1）分子量－在样品预处理或GPC分析时有用（2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）；（3）选择合适的色谱柱；（4）溶解度－选择流动相的条件（5）官能团－有否离子化基团？保留特性如何？（6）样品的基质－考虑是否要前处理，如何前处理当前36页，总共118页。液相色谱分析液相色谱分析方法的建立2续前一页（7）选择合适的K’值的条件；（8）选择良好的峰位（a值）；（9）选择良好的色谱柱条件（N值）；（10）检测特性－是否有紫外吸收？荧光？（11）用实测样品解决出现的特殊问题；（12）证实方法的正确性。当前37页，总共118页。方法样品特点/色谱柱何时应用该方法反相HPLC流动相：水/有机溶剂色谱柱：C18（ODS），C8，苯基，三甲基硅烷，氰基首选为能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物。离子对HPLC流动相：水/有机溶剂（一种缓冲物控制pＨ和离子对试剂）色谱柱：C18（ODS），C8，氰基离子或可电离化合物，尤其是碱性或阳离子化合物的良好选择正相HPLC流动相：有机溶剂混合液色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅胶当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择；首选为不溶于水/有机混合液的亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC硅胶最好液相色谱分析选择液相色谱的方法主要液相色谱方法特性当前38页，总共118页。方法描述/色谱柱何时应用该方法离子交换色谱法流动相：水相，另以缓冲物控制pH色谱柱：阳离子或阴离子交换分离无机离子混合物的首选（离子色谱法）；分离蛋白质、核酸样品及有关化合物的良好选择体积排阻色谱法流动相：水相（GFC）或有机相（GPC）色谱柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯乙烯或硅胶，孔径大小支配分子量范围分离大分子样品，如蛋白质和人造聚合物的良好首选，也可用于测量分子量的分布疏水作用色谱法流动相：盐溶液色谱柱：类似于反相填料，但疏水性小得多用于分离蛋白质液相色谱分析选择液相色谱的方法次要液相色谱方法特

性当前39页，总共118页。液相色谱分析液相色谱的保留保留时间tR的初步估计：保留时间tR＝死时间t0(1+峰容量因子k’）峰的容量因子k’＝（保留时间tR－死时间t0）/死时间t0t0≈0.5Ld2

左式中：t0－进样峰的出峰时间k’=(tR-t0)/t0tR－峰的保留时间L－柱长(cm)tR=t0(1+k’)d－柱内径(cm)

k’－峰的容量因子

当前40页，总共118页。液相色谱分析反相色谱不同配比流动相与容量因子值甲醇/水乙腈/水四氢呋喃/水峰容量因子值0/1000/1000/10010010/906/944/964020/8012/8810/901630/7022/7817/83640/6032/6823/772.550/5040/6030/70160/4050/5037/630.470/3060/4045/550.280/2073/2753/470.0690/1086/1463/370.03100/0100/072/280.01当前41页，总共118页。液相色谱分析溶剂强度

改变流动相的组成或溶剂的强度，就可以改变K’和tR。在一定的条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂（小tR和K’值）为强溶剂，增加或延长分析时间的溶剂（大tR和K’值）为弱溶剂。例如，在反相色谱中，水是弱溶剂。在甲醇/水为流动相的系统中增加甲醇的比例，流动相变强。液相色谱的溶剂由弱到强排列的顺序为：正己烷、氯仿、二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、丙醇、甲醇。

在反相色谱中有机溶剂增加10％左右，tR和K’值要减少2-3倍。当前42页，总共118页。液相色谱分析峰位的重排在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的tR，不会发生峰位重排。在反相色谱中，下列条件改变可能发生峰位重排：（1）流动相中换了强溶剂种类；（2）pH值的改变；（3）柱填料的改变；（4）柱温的改变；（5）流动相组成的改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）当前43页，总共118页。液相色谱分析液相色谱压力计算(4.6内径柱)式中：L――柱长，(mm)；e――流动相粘度；F――流速，mL/mindc――柱内径，(mm)；dp――柱填料直径，(mm)反相色谱常用流动相的粘度值（mPa·s）（25℃）有机溶剂/水（体积比）甲醇乙腈四氢呋喃0/1000.890.890.8920/801.40.981.2240/601.620.891.3860/401.540.721.2180/201.120.520.85100/00.560.350.46注1：左表红线框内的数字即为该溶液与水混合后的粘度（在25℃时）即e注2：以上计算公式是针对新柱而言。当前44页，总共118页。液相色谱分析实验室常备的流动相和固定相

为满足液相色谱的方法选择，实验室应该常备以下的流动相和固定相（1）流动相：甲醇、乙腈、纯水、四氢呋喃、正己烷二氯甲烷，这些溶剂基本上能满足90％以上的液相色谱分离问题。（2）固定相：C18键合相柱、硅胶柱、氰基柱合氨基柱。几点注意事项

色谱柱和流动相确定以后，为想获得满意的色谱分离，可进一步选择柱长、填料粒度和流速等。需要指出的是某些样品在进样前要进行很完全的样品预处理，另外，许多样品则需要梯度洗脱，当色谱条件有所改变时，需要寻找更合适的分离条件。当前45页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发第一步干什么？想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法；查文献，各种手册，如药典、农药手册以及国家标准；向仪器制造商询问。对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法。充分了解自己的样品当前46页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高？样品的本底是否很复杂？有多少组分要分析？对分析的精确度、准确度等有多高要求？是否因是日常检验而要求方法容易使用？当前47页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发分离时要了解哪方面的情况？要分离的样品量有多大？要分离的组分在样品中的含量很高还是微量？是否需要保持生物活性？对分离产物纯度的要求有多高？纯度和活性的鉴定如何完成？当前48页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发一般的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k值改变保留值调节a值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度请记住每次改变一个参数当前49页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发使用文献方法色谱柱填料的种类、品牌是否相同？注意文献方法的流动相是否损害色谱柱？如色谱填料品牌不同，需要调整流动相。注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）当前50页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发色谱方法转换如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量：转换流速：D＝内径；L＝长度当前51页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发离子型化合物的分离方式使用离子交换柱：离子交换法主要用于强的阴、阳离子样品使用反相柱：离子抑制色谱法通过改变流动相的PH值，使样品呈中性

离子对色谱法加入“对离子”试剂，使样品呈中性当前52页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2－8（较保险值3－7）内当前53页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发离子抑制色谱的使用范围如果：一些酸在pH低于2时还保持离子化；一些碱在pH高于7时还保持离子化；可以有以下的选择：离子交换色谱；使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法；使用离子对色谱法。当前54页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发离子对色谱法在反相色谱流动相中加入“离子对”试剂与样品中可电离的组分形成“对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型：磷酸季丁铵，适用于弱酸烷基磺酸盐，适用于弱碱烷基长度不同，形成对离子的能力不同磷酸二丁胺，适用于弱碱当前55页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发方法开发的其它因素流速对柱效的影响不同内径的色谱柱有对自己的最佳流速样品的进样浓度对柱效的影响样品的进样体积对柱效的影响溶剂的粘度对柱效的影响以上因素均影响分离度当前56页，总共118页。液相色谱分析

分析方法的开发结论充分用已知样品结构确定以哪种方法开始普通反相？离子抑制？离子对？还是其它观察流动相条件改变时色谱峰的移动根据变化的方向及大小决定下一步干什么改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！色谱柱的改变影响最大当前57页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例等度分析色谱柱：C18，4mm×30mm流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱流速：2ml/min样品：①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)当前58页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例改变容量因子k'当前59页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例改变选择性∶a通过改变流动相改变选择性同样强度的不同溶剂改变色谱柱123THF/H2O28:72MeOH/H2O58:42CH3CN/H2O38:62当前60页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法的建立梯度洗脱的特点优点单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式柱需再生定量分析的重复性较低分析时间长当前61页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度的洗脱方式高压梯度及低压梯度溶剂A溶剂B泵A泵B混合器A高压梯度溶剂A泵溶剂B比例阀（溶剂混合点）混合器B低压梯度（溶剂混合点）当前62页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度洗脱的可变参数A及B(可能还有C和D液)的成分和化学特性梯度的陡度梯度的变化形状当前63页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例如不用梯度：分离不理想当前64页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度条件的优化当前65页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度曲线的变化∶凹线当前66页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度曲线的变化∶凸线当前67页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度平衡时间的影响（一）10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复当前68页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度平衡时间的影响（二）平衡时间∶6分钟平衡时间∶7分钟平衡时间∶8分钟平衡时间∶9分钟平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。当前69页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例有机污染物的影响（一）50ml超纯水的有机物污染状态当前70页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例有机污染物的影响（二）“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析当前71页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例有机污染物的影响（三）典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析当前72页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第一步开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100%水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好当前73页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第二步为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。当前74页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第三步

从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。当前75页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第四步

空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。当前76页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第五步

根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。当前77页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第六步

根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。当前78页，总共118页。液相色谱分析

分析方法建立的实例梯度方法开发实例-第七步最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。当前79页，总共118页。液相色谱仪的使用流动相储液器1.最好使用专用的溶剂瓶来放置流动相2.改变流动相时防止交叉污染.3.不要使用陈旧的流动相.4.定期清洗或更换流动相储液瓶.5.使用烧结不锈钢吸滤头6.定期清洗烧结不锈钢吸滤头.当前80页，总共118页。液相色谱仪的使用对流动相的要求

由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：

（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。

（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。当前81页，总共118页。液相色谱仪的使用对流动相的要求

（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50—1OOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.当前82页，总共118页。液相色谱仪的使用常用流动相的紫外截止波长溶剂正己烷二硫化碳四氯化碳苯氯仿二氯甲烷四氢呋喃丙酮乙腈甲醇水紫外截止波长nm190380265210245233212330190205187当前83页，总共118页。液相色谱仪的使用常用流动相的强度参数溶剂ε0溶剂ε0溶剂ε0氟烷－0.25苯0.32乙腈0.65正戊烷0.00氯仿0.40吡啶0.71石油醚0.01甲乙酮0.51正丙醇0.82环己烷0.04丙酮0.56乙醇0.88四氯化碳0.18二乙胺0.63甲醇0.95当前84页，总共118页。液相色谱仪的使用良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效定期检测仪器的谱带宽度当前85页，总共118页。液相色谱仪的使用色谱柱的使用及操作流动相的转换特别是GPC柱流速（压力）的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱：样品及溶剂的要求记住：拿到一根从未用过的色谱柱时一定要先看使用说明！当前86页，总共118页。液相色谱仪的使用色谱柱的保养1样品方面除去微粒和杂质。了解样品在流动相中的溶解度。如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出。了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用当前87页，总共118页。液相色谱仪的使用色谱柱的保养2流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值要在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例当前88页，总共118页。液相色谱仪的使用在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱当前89页，总共118页。液相色谱仪的使用在线过滤器在线过滤器防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效在需要高柱效的分析中常用（如氨基酸分析）可更换的消耗品更换滤芯更换垫圈当前90页，总共118页。液相色谱仪的使用保护柱可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是使用微柱时保护柱的种类普通自装填料的保护柱用户自装填料影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大ONGUARD预装保护柱有各种填料的预装柱供选择，使用方便。填料容积小，也引起柱效降低当前91页，总共118页。液相色谱仪的使用常用流动相的强度参数对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100－200ml依次活化键合相柱（烷基）的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗记住：每种色谱柱可能有特定的方法，一定要先看其使用说明当前92页，总共118页。液相色谱仪的使用色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放温度当前93页，总共118页。液相色谱仪的使用色谱柱常见毛病柱压过高多少才算高？不同色谱柱有差异不同系统有差异不同溶剂有差异柱效低重复性差不出峰，回收率低当前94页，总共118页。液相色谱仪的使用柱压过高为什么柱压会过高？微粒堵塞样品中微粒流动相中微粒密封垫柱床膨胀不可逆吸附细菌生长当前95页，总共118页。液相色谱仪的使用柱效低为什么柱效低？色谱柱被污染过滤片部分堵塞样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞色谱柱内的死体积流动相pH值及组成不合适造成固定相流失流速急剧变化造成固定相物理损坏机械震动造成固定相产生裂缝柱床收缩或干枯当前96页，总共118页。液相色谱仪的使用重复性差、回收率低实验的重复性差色谱柱被污染流动相pH值及组成不合适造成键合相流失样品溶剂不同或样品本身不稳定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相过强或流动相过弱非特异性吸附当前97页，总共118页。液相色谱仪的使用色谱柱以外的因素1“柱效”问题不一定是色谱柱问题！仪器问题：连接不好造成死体积进样器检测器管路、连接口保护柱在线过滤器堵塞流动相问题：色谱柱未平衡好进样量太大当前98页，总共118页。液相色谱仪的使用色谱柱与仪器的连接不同公司产品，其接头不同。处理不当会造成：色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏解决办法：自制相应的转换接头使用通用型接头（刃环和螺母）这种刃环在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。当前99页，总共118页。液相色谱仪的使用色谱柱以外的因素2柱压过高的问题，不一定是色谱柱问题！系统反压问题阻尼器堵塞进样器堵塞管路或连接口堵塞在线过滤器不干净保护柱压力传感器不准确流速是否错误？当前100页，总共118页。液相色谱仪的使用色谱柱以外的因素3实验的重复性差梯度实验时平衡时间不足温度波动流动相组成改变样品溶剂不同样品稳定性不好方法的开发不好缓冲液的pH值不合适缓冲液的缓冲能力不足当前101页，总共118页。液相色谱仪的使用简单的判别方法高的柱反压是否伴随着保留时间的变化？峰形变坏？分辨率变坏？测量色谱系统的谱带展宽典型的分析系统应远小于100微升如大于此数应检查仪器系统当前102页，总共118页。液相色谱仪的使用测量色谱系统的谱带展宽卸下色谱柱，用管子代替之按测柱效方法，以1/10的样品浓度进样，大约2－5微升用5σ方法测4.4%峰高处的峰宽：W仪器参数：流速1.0ml/min检测器灵敏度：0.5-1.0AUFS（用记录仪时）检测器时间常数：小于0.2谱带展宽（ml）＝1000×W（min）（工作站）当前103页，总共118页。液相色谱仪的使用设备和材料：溶剂过滤器、真空泵、0.45u或更细的水性滤膜和有机滤膜过滤的方法：用加了滤膜的溶剂过滤器和真空泵抽滤过滤的目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。必须做!

溶剂和水的前处理：过滤当前104页，总共118页。液相色谱仪的使用脱气的目的：使色谱泵的输液准确

输液均匀准确，且脉动减小。保留时间及色谱峰面积的重现性提高

提高检测的性能

防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低

保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化必须做!

溶剂和水的前处理：脱气当前105页，总共118页。液相色谱仪的使用流动相脱气的方法：抽真空：同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波：简单，但效果不理想脱气机：可保持连续脱气，多用于低压梯度通氦气：可保持连续脱气，多用于低压梯度加热：简单、如同抽真空一起使用，其效果很好但容易造成流动相组成的变化必须做!

溶剂和水的前处理：脱气当前106页，总共118页。液相色谱仪的使用分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性

柱温控制的优点：使用柱温箱当前107页，总共118页。液相色谱仪的使用高压输液泵1.每次使用后要把泵中的含盐缓冲液洗干净，防止盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂中。2.使用HPLC级的流动相试剂.3.使用不锈钢烧结吸液滤头