微生物学第五章 微生物的营养和生长

微生物的营养和生长第五章5．1

微生物的营养

营养素:

指具有营养功能的物质。在微生物学中，还包括光能这种非物质形式的能源在内。通过新陈代谢，微生物与外部环境进行物质和能量交换，从环境中获得各种物质以合成细胞物质。微生物的营养物可为它们正常生命活动提供结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。

22023/3/28微生物的六种营养要素：

碳源氮源能源生长因子无机盐水5.1.1微生物的六大营养素32023/3/28(1)碳源定义：凡能够提供微生物营养所需碳元素的营养源。可在微生物体内通过一系列复杂的化学变化合成细胞物质。并为机体提供生理活动所需要能量。异养微生物：凡必需利用有机碳源的微生物。自养微生物：凡能利用无机碳源的微生物。对异养微生物来说，它的碳源同时又可作能源。42023/3/28碳源种类：有机碳源、无机碳源碳源来源：糖类、醇类、醛类、有机酸类和脂类等。碳源利用效果：单糖>双糖>己糖>戊糖>淀粉>纤维素微生物发酵工业所利用物质：葡萄糖、糖蜜（制糖工业副产物）、淀粉（玉米、土豆、大米、山芋等）、纤维素52023/3/28(2)氮源定义：凡能提供微生物生长繁殖所需要氮元素的营养源。氮源种类：

①空气中分子态的氮，只有少数具有固氮能力的微生物能利用。

②无机氮化合物（如铵态氮、硝态氮）和简单有机氮化物（如尿素），大多数微生物都能利用。62023/3/28③有机氮化合物，大多数寄生性微生物和一部分腐生性微生物需要其为必须氮素营养，这类微生物可称“氨基酸异养型微生物”。所有的动物和大量的异养微生物是氨基酸异养型生物；所有的绿色植物和很多的微生物都是氨基酸自养型生物。72023/3/28常见氮源来源：

铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、血粉等以及豆饼粉、花生饼粉等。氮源利用效果：

（N、C、H、O）或（N、C、H、O、X）类。优于（N、O）类。最不易利用是（N）类。注意：氮源一般只提供合成细胞质和细胞其它结构的原料，不作为能源，只有少数细菌例外。82023/3/28能源谱(3)能源定义：能为微生物生命活动提供最初能源来源的营养物或辐射能。化学物质有机物：化能异养微生物的能源（同碳源）无机物：化能自养微生物的能源（不同于碳源）辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源92023/3/28一种营养物通常有一种以上营养要素功能的例子。还原态无机养料常具有双功能（如NH4+，既是硝酸细菌的能源，又是其碳源）甚至还有三功能的（能源、碳源、氮源）营养物。有机物常有双功能或三功能，如：“N·C·H·O”类营养物常是异养微生物的能源、碳源兼氮源。102023/3/28(4)生长因子定义：是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自己合成的有机物。生长因子广义的生长因子：除维生素外，还包括碱基、卟啉及其衍生物，C４—C６分枝或直链脂肪酸，以及需要量较大的氨基酸。狭义的生长因子：一般仅指维生素。112023/3/28

生长因子自养型微生物生长因子异养型微生物生长因子过量合成的微生物微生物与生长因子的关系122023/3/28生长因子自养型微生物

多数真菌、放线菌和不少细菌，如大肠杆菌等都是不需要外界提供生长因子的生长因子自养型微生物。真菌放线菌大肠杆菌132023/3/28

②生长因子异养型微生物

它们需要多种生长因子，如乳酸细菌、各种动物致病菌、原生动物和支原体等。

乳酸菌

多种维生素需要营养缺陷型（突变株）不同的嘌呤、嘧啶碱基需要支原体甾醇需要炭疽芽孢杆菌硫胺素(B1)需要142023/3/28③生长因子过量合成微生物

有些微生物在其代谢活动中，会合成出大量的维生素及其他的生长因子，因此，它们可以作为维生素等的生产菌。阿舒假囊酵母维生素B2生产谢氏丙酸杆菌维生素B12生产152023/3/28无机盐定义：是微生物生长必不可少一类营养物。它们为机体提供必需的金属元素。这些金属元素在机体中的生理作用：

参与酶的组成，调节酶的活性，维持细胞结构的稳定性，调节与维持细胞的渗透压平衡，控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。162023/3/28无机盐生理功能：172023/3/28

一般微生物生长所需要的无机盐浓度在10-3～10-4mol•L-1范围内,称为常量元素，如P、S、k、Mg、Ca、Na和Fe等；凡所需浓度在10-6～10-8mol•L-1范围内,称为微量元素，如Cu、Zn、Mn、Co等。无机盐浓度：182023/3/28除了少数微生物如蓝细菌能利用水中的氢作为还原二氧化碳时的还原剂外，其它微生物都不能利用水作为营养物，但它在微生物的代谢中起着重要作用。生理功能：是微生物细胞重要组成部分；参与机体内一系列生理生化反应；参与营养物质吸收与代谢产物分泌；可有效吸收代谢过程中放出的热，并迅速地散发出去，避免细胞内温度突然升高。水192023/3/285.1.2微生物营养类型以能源分：光能营养型和化能营养型；以供氢体分：无机营养型和有机营养型；以碳源分：自养型和异养型；根据以上分类，我们通常把微生物分成以下四类：202023/3/28光能无机营养型（光能自养型）光能有机营养型（光能异养型）化能无机营养型（化能自养型）化能有机营养型（化能异养型）除此之外，还有其它划分类型。212023/3/28(1)光能无机营养型（光能自养型）能以CO2作为主要碳源或唯一碳源能源光氢供体无机物蓝细菌、紫硫细菌、绿硫细菌、藻类222023/3/28(2)光能有机营养型（光能异养型）能以CO2及简单有机物作为主要碳源或唯一碳源能源光氢供体有机物红螺菌科的细菌（即紫色无硫细菌）232023/3/28(3)化能无机营养型（化能自养型）无机物氧化过程中放出的化学能作为生长所需要的主要能量来源。碳源CO2氢供体无机物硝化细菌、硫化细菌、铁细菌、氢细菌、硫黄细菌等242023/3/28(4)化能有机营养型（化能异养型）有机物氧化过程中放出的化学能作为生长所需要的主要能量来源。碳源有机物氢供体有机物绝大多数细菌和全部真核微生物252023/3/28以合成氨基酸能力分：氨基酸自养型和氨基酸异养型；以生长因子分：原养型和营养缺陷型；以摄食方式分：渗透营养型和吞噬营养型；以摄取死或活有机物分：腐生和寄生262023/3/28营养物质能否进入细胞取决于三个方面的因素：营养物质本身的性质（相对分子量、溶解性、电负性等）微生物所处的环境（温度、pH等）微生物细胞的透过屏障（原生质膜、细胞壁、荚膜等）5.1.3营养物质进入细胞方式272023/3/28细胞膜上无载体蛋白：单纯扩散细胞膜上有载体蛋白不消耗能量：促进扩散耗能量运送前后溶质分子不变：主动运送运送前后溶质分子改变：基团移位根据物质运输过程的特点，可将物质的运输方式分为:282023/3/281．单纯扩散

又称被动运送，它是由高浓度的胞外环境向低浓度胞内环境扩散，这种扩散是非特异性的。它不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式。特点物质在扩散过程中没有发生任何反应；不消耗能量，不能逆浓度运送营养物质；运输速率与膜内外物质的浓度差成正比292023/3/28水可以自由通过原生质膜。脂肪酸、乙醇、甘油、一些气体（O2、CO2）及某些氨基酸在一定程度上也可以自由通过原生质膜。302023/3/282．促进扩散特点不消耗能量参与运输的物质本身的分子结构不发生变化不能进行逆浓度运输运输速率与膜内外物质的浓度差成正比需要载体参与

营养物质在运输过程中不需要代谢能量，营养物质运送时，需要借助膜上一种载体蛋白参与，每种载体蛋白只运送相应物质。促进扩散只对生长在高营养浓度下微生物发挥作用。312023/3/28

通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有氨基酸、单糖、维生素及无机盐等。322023/3/283．主动运送

它的一个重要特点是物质运输过程中需要消耗能量和载体，而且可以进行逆浓度运输。

是微生物吸收营养物质的主要方式。它不仅需要特异性载体蛋白参与运送过程，而且需要提供能量（ATP）。载体蛋白与被运送物质之间亲和力大小的改变是由于载体蛋白构型变化而引起。它不依赖于细胞膜内外被运送物质的浓度差，可进行逆浓度梯度运送。332023/3/28

主动运送的例子很多，主要有无机离子、有机离子和一些糖类（乳糖、葡萄糖、麦芽糖或蜜二糖）342023/3/284．基团移位

是一种特殊类型主动运送，其特点是营养物质在运送过程中需要载体蛋白和能量(ATP等)，并且物质分子还发生化学结构变化。例如，运送葡萄糖分子是依靠磷酸转移酶系统，即磷酸烯醇式一己糖磷酸转移酶系统。352023/3/28(1)热稳定载体蛋白的激活。酶1PEP+HPr→P-HPr+丙酮酸

←(2)糖被磷酸化后运入膜内。酶2P-HPr+糖→糖-P+HPr

细胞外细胞内

基团转位又称为磷酸烯醇式丙酮酸--磷酸糖转移酶运输系统（PTS），PTS通常由五种蛋白质组成，包括酶I、酶II（包括a、b、c三种亚基）和一种低相对分子量的热稳定性蛋白质（HPr）。362023/3/28

主要用于糖的运输，脂肪酸、核苷、碱基等也可以通过这种方式运输。372023/3/28比较项目单纯扩散 促进扩散主动运输基团移位特异载体蛋白无

有

有

有

运送速度 慢 快 快 快 溶质运送方向由浓至稀

由浓至稀

由稀至浓

由稀至浓平衡时内外浓度内外相等

内外相等

内部高

内部高

运送分子 无特异性 特异性 特异性 特异性 能量消耗 不需要

不需要

需要

需要

运送前后溶质分子不变 不变 不变 改变 载体饱和效应 无

有

有

有 与溶质类似物无竞争性 有竞争性 有竞争性 有竞争性

运送抑制剂 无

有

有

有 运送对象举例水、O2

糖、SO42-氨基酸、乳糖葡萄糖\嘌呤四种运送营养方式的比较382023/3/28392023/3/285.1.4培养基培养基（medium）是人工配制的，适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的混合营养基质。培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。

402023/3/28

任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养素：碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水

培养基配制好后，必须立即进行灭菌处理,否则很快引起杂菌生长。412023/3/28①根据微生物的营养需要配制；②营养协调；③最适的物理化学条件（pH，渗透压）④经济原则。(1)培养基配制原则和方法422023/3/28根据不同的微生物的营养要求配制针对性强的培养基，例如：①根据微生物的营养需要配制培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为：S10gMgSO4.7H2O0.5g(NH4)2SO40.4gFeSO40.01gH3PO44gCaCl20.25gH2O1000ml培养化能异养的大肠杆菌一种培养基是由下列化学成分组成：葡萄糖5gNH4H2PO41gNaCl5gMgSO4.7H2O0.2gK2HPO41gH2O1000ml432023/3/28常见的培养四大类微生物的培养基细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5gH2O1000mlpH7.4放线菌（高氏1号）淀粉20gK2HPO40.5gNaCl0.5gMgSO4.7H2O0.5gKNO31gFeSO40.01gH2O1000ml酵母菌(麦芽汁培养基)

麦芽粉加四倍水，在60℃--65℃保温糖化7-8小时，用碘液试验检查至糖化完全为止，调整糖度为10Be,煮沸后，沙布过滤，调pH为5.0。霉菌（察氏合成培养基）NaNO33gK2HPO41gKCl0.5gMgSO4.7H2O0.5gFeSO40.01g蔗糖30gH2O1000ml442023/3/28②营养协调培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好。营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用。

培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。452023/3/28pH培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。通常培养条件：细菌：pH7.0-8.0

放线菌：pH7.5-8.5酵母菌：pH3.8-6.0霉菌：pH4.0-5.8为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在工业发酵时补加酸、碱等。③理化条件适宜462023/3/28微生物在等渗的溶液中生长最好；渗透压在高渗的溶液中微生物细胞会发生质壁分离。在低渗的溶液中微生物细胞会吸水膨胀破裂；

此外，水分活度、溶液中氧化还原电位对微生物的生长都有影响。472023/3/28

在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同条件下纯水蒸汽压力之比表示，即：

αw=Pw/Pow式中Pw代表溶液蒸汽压力,POw代表纯水蒸汽压力。纯水αw为1.00,溶液中溶质越多,αw越小。微生物一般在αw为0.60～0.99的条件下生长,αw过低时,微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适αw不同。

水分活度482023/3/28氧化还原电位又称氧化还原电势（redoxpotential），是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3～+0.4伏为宜；厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸,+0.1伏以下时进行发酵。氧化还原电位492023/3/28以粗代精以野代家以废代好以国代进以简代繁以氮代朊以烃代粮以纤代糖④经济节约502023/3/28(2)培养基的类型

培养基种类繁多，根据其成分、外观的物理状态和用途可将培养分成多种类型。按成分不同划分天然培养基组合培养基半组合培养基①按成分不同划分:512023/3/28指利用动、植物或微生物或其提取物制成培养基，不明确其中的营养成分。

天然培养基优点：取材方便、营养丰富、种类繁多、配制方便缺点：确定成分不明确，也不稳定，做精确科学实验时，数据不稳定，因此，只适合配制实验室的各种基本培养基及大生产中的种子培养基或发酵培养基。牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基522023/3/28

组合培养基是一类用几种化学试剂配制成的、各成分的量都确切知道的培养基。优点：成分精确，重复性好；缺点：价格较贵，配制麻烦，一般用于营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌种鉴定和生物测定等定量要求较高的研究工作中。高氏1号培养基、察氏培养基532023/3/28

半组合培养基即一部分营养物质是天然成分，一部分是化学试剂的培养基。严格地讲，凡是含有未经特殊处理的琼脂的任何组合培养基，实质上都只能看做是一种半组合培养基。马铃薯蔗糖培养基542023/3/28按物理状态不同划分固体培养基液体培养基半固体培养基

凝固培养基非可逆性凝固培养基天然固体培养基滤膜②按外观的物理状态划分:552023/3/28

固体培养基

在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态的培养基。琼脂含量一般为1.5%-2.0%

固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏。562023/3/28

半固体培养基

琼脂含量一般为0.2%-0.7%

观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价测定、各种厌氧菌的培养以及菌种保藏等。572023/3/28

液体培养基

不加任何凝固剂培养基呈液体状态，大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。582023/3/28粘液型菌落菌膜菌沉淀均匀浑浊对照固体培养基液体培养基半固体培养基592023/3/28③按用途不同划分按用途不同划分基础培养基鉴别性培养基选择性培养基加富培养基牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等602023/3/28选择性培养基根据某种微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，其目的是使混合菌样中劣势菌大量生长成优势菌，从而提高该菌筛选效率。612023/3/28选择培养基（selectivemedium)622023/3/28鉴别性培养基培养基中加有能与某种菌的代谢产物发生显色反应的指示剂，通过肉眼可观察出该菌菌落与外形相似的其他菌落相区分的培养基。用于鉴别不同类型微生物的培养基。以上关于选择培养基与鉴别培养基区分是人为的、理论上的。在实际应用中，这两种功能常结合在一种培养基中。632023/3/28鉴别培养基（differentialmedium）642023/3/285.2微生物的生长

5.2.1

微生物的生长、繁殖微生物的生长现象：微生物在适宜条件下，不断地吸收营养物质，并按自身代谢方式进行新陈代谢，如同化作用大于异化作用，其结果是原生质总量（包括重量、体积、大小)不断地增加。微生物繁殖：单细胞微生物如细菌的生长，往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形成两个相似的子细胞，子细胞又重复上述过程，使细胞数目增加。在多细胞微生物中，细胞数目的增加如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能叫繁殖。652023/3/28

个体生长→个体繁殖→群体生长

群体生长=个体生长+个体繁殖662023/3/28代表微生物的个体繁殖方式细菌酵母菌霉菌噬菌体两分裂Binaryfision芽殖有性或无性孢子复制672023/3/285.2.2微生物生长量的测定方法测生长量⑴直接法：a测体积；b测干重。⑵间接法：a生理指标（测定细胞总含氮量来确定细菌浓度；测定含碳量；测定DNA、RNA、ATP和N-乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产气、产二氧化碳、耗氧、黏度和产热等指标)。⑶比浊法682023/3/28干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。692023/3/28比浊法原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。702023/3/28计数法：⑴直接法：a比例计数法b血球计数板法⑵间接法：a平板菌落计数法b液体稀释法快速测定法712023/3/28血球计数板法722023/3/28各种型号的全自动血球计数仪血球计数板732023/3/28742023/3/28１个计数室＝１×１mm包含５×５个中方格１个中方格＝４×４个小方格752023/3/28平板菌落计数法762023/3/28平板菌落计数的一般步骤772023/3/28平板菌落计数法技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作782023/3/28稀释倒平板法

（倾注法（混菌法）、涂布法）这是最常用的纯种分离法，先将待分离的材料作一系列的稀释(如1：10、1：100、1：1000、1：10，000……)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。792023/3/28802023/3/28划线法将已熔化的培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，用接种环沾取少许待分离的材料，在培养基表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物将随着划线次数的增加而分散，经保温培养形成菌落。划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起。由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落。这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。用其他工具如弯形玻璃代替接种环，在培养基表面涂布，亦可得到同样结果。此法较为简便。812023/3/28822023/3/28832023/3/28单细胞挑取法这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。842023/3/28利用选择培养基分离法不同微生物需要不同的营养物质。有些微生物生长适于酸性环境，有些则适于碱性环境。各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂(酚)、染料(结晶紫等)、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。另外，也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。对一些生理类型比较特殊的微生物，为了提高分离机率，往往在涂布分离前先进行富集培养，其目的是提供一个特别设计的培养环境，以帮助所需的特殊生理类型的微生物的生长，而不利于其他类型微生物的生长。852023/3/28选择培养基分离法1.dilutesample1ml9ml10

1001000104105

106107牛肉膏培养基土豆培养基高氏培养基862023/3/28液体稀释法872023/3/2810n10n-210n-1882023/3/28微生物纯培养分离方法的比较

稀释平板法既可定性，又可定量，用途广泛

平板划线法方法简便，多用于分离细菌

单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究

利用选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊的微生物892023/3/28比例计数法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适

于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取

0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代

入公式：

每ml原菌液含菌数

=视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×100×稀释倍数902023/3/28

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般是将lmm等分为100格，每格长0.01mm(即10um)，用于校正目镜测微尺每格的相对长度。

目镜测微尺是一块中央有精确的等分刻度的圆形小玻片，置于接目镜中的隔板上。目镜测微尺每小格所代表的实际长度不一样，测量前，必须先用镜台测微尺进行校正。912023/3/28目镜测微尺镜台测微尺利用镜台测微尺测定目镜测微尺的每格绝对值目镜测微尺测定微生物大小922023/3/28滤膜计数法932023/3/28标签螺纹预湿棉签裂解液溶解液虫荧光素酶荧光素粉末棉签擦拭检测物棉签插入kit并拧紧放入仪器读数30秒钟得到结果Kit操作过程便携式细菌总数快速测定设备942023/3/285.2.3微生物群体生长规律多数细菌的繁殖速度很快。大肠杆菌在适宜的条件下繁殖48h，其子代总重可达2.2×1031g，这是一个巨大的数字。然而，实际情况是不可能的。那么，细菌的群体生长规律到底怎样呢?952023/3/28将少量单细胞纯培养物接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定细胞含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细胞数量并不增加，随之细胞数目增加很快，继而细胞数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细胞数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为生长曲线。962023/3/28在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。生长曲线972023/3/28微生物的典型生长曲线(growthcurve)总菌数活菌数培养时间/h

Ⅱ.指数期Ⅲ.稳定期Ⅳ.衰亡期Ⅰ.延滞期细菌数目（个/ml）对数ⅡⅢⅣⅠ

根据微生物的生长速率常数的不同，可将生长曲线大致分为四个时期：

982023/3/28

992023/3/28●绘制曲线条件1）分批培养2）细胞数目的对数为纵坐标1002023/3/28①延滞期：(Lagphase)

定义：指把少量微生物接种到新培养液开始的一段时间，其细胞数目不增加甚至也可能减少。延滞期(1)

典型的生长曲线1012023/3/28特点：

①生长速率常数为零；

②细胞体积增大，DNA含量增多，为分裂做准备；③合成代谢旺盛，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶；④对不良环境如pH、NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学物质敏感。延滞期特点：1022023/3/28具体方法：以对数期的菌体作种子菌，缩短延滞期；适当增大接种量；种子培养基营养成分尽量接近发酵培养基；发酵工业常采取措施缩短延滞期1032023/3/285.2.3微生物群体生长规律对数期(Logarithmicphase)定义:指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。此时菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，细胞代时短，细胞进行平衡生长。菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，群体形态与生理特征最一致，抗不良环境能力强。1042023/3/28②对数期(Logarithmicphase)对数期1052023/3/28生长速率常数R：指细胞每小时的分裂次数。代时G：细胞每分裂一次所需的时间。R=1/G1062023/3/28G=(t2-t1)/n=(t2-t1)/3.322(lgX2-lgX1)R=1/G=3.322(lgX2-lgX1)/(t2-t1)

X2=X1·2n两边取对数：lgX2=lgX1+nlg2（lg2=0.301）n=3.322(lgX2-lgX1)

x2x1t1t21072023/3/28例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经4h（t）后增加到49，000，000（b），这样，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。1082023/3/28特点①生长速率常数R最大，代时G最短；

②整个群体的生理特性较一致；③细胞各成分平衡增长，生长速率恒定④酶系活跃，代谢旺盛1092023/3/28影响因素：①菌种。不同微生物代时差别大，即使是同一菌种，由于培养基成分和物理条件不同，其对数期的代时也不同.②营养成分。同种细菌，营养丰富的培养基，其代时短。③培养温度。温度是影响微生物生长速率的重要物理因素。1102023/3/28影响代时长短的因素（1）菌种（2）营养成分（3）营养物浓度（4）培养温度细胞数或菌体量时间8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml营养物浓度对生长速度和菌体产量的影响1112023/3/28③稳定期（stationaryphase）

又叫最高生长期或恒定期，其特点是新繁殖的细胞数与衰亡细胞数几乎相等，即正生长与负生长达动态平衡，生长速度逐渐趋向于零。稳定期1122023/3/28

①生长速率常数R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等；②菌体产量达到最高点，且产量与营养物质的消耗出现有规律的比例关系，用生长产量常数Y表示；Y=(X-X0)/C0-C=(X-X0)/C0

X：稳定期的细胞干重(g/ml培养液）X0：刚接种时的细胞干重C0

：限制性营养物的最初浓度(g/ml)C：稳定时期限制性营养物的浓度1132023/3/28营养物质特别是生长限制因子耗尽；营养物质比例失调（C：N）；酸、醇、毒素或过氧化氢等有害产物累积；pH，氧化还原电势等环境条件越来越不适宜等。稳定期出现原因1142023/3/28③通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建；①对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸)等为目的的一些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期：②是对维生素、碱基和氨基酸等生长因子进行生物测定的最佳测定时期；稳定期的实践意义1152023/3/28稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物。稳定期的微生物，在数量上达到最高水平，产物积累也达到高峰，菌体的总产量与所消耗营养物质间存在着一定关系。此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，促进了连续培养技术的产生和研究。生产上常通过补料、调节温度和pH等措施，延长稳定期，以积累更多代谢产物。稳定期在发酵工业上的应用1162023/3/28④衰亡期(declinephase)稳定期后，微生物死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”。衰亡期1172023/3/28细胞形态多样，例如产生很多膨大、不规则退化形态、有的细胞多液泡；革兰氏染色反应为阳性的变成阴性；有的微生物因蛋白水解酶活力增强发生自溶；有的微生物此时产生抗生素等次生代谢产物；对于芽孢杆菌，芽孢释放往往也发生在这一时期。衰亡期特点1182023/3/28稳定期到来的主要原因营养物尤其是生长限制因子的耗尽；有害代谢产物的累计；理化条件的不适宜等；1192023/3/28(2)微生物的连续培养

：其原理是根据培养器内微生物生长密度，用光电控制系统来检测培养液的浊度（即菌液浓度），并控制培养液流速，从而获得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养液。恒浊法1202023/3/28在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同菌体密度.主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物。生产实践上，为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，可采用此法.1212023/3/28恒浊连续培养通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业1222023/3/28原理是使培养液流速保持不变，即控制在恒定的流速，使微生物始终在低于最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养方法。此法是与生长速率相关的各种理论研究。主要获得不同生长速率的菌体；恒化法1232023/3/28常通过控制某一种营养物的浓度，使其成为限制性的因子，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。随着细菌生长，菌体密度会随时间增长而增高，而限制性生长因子浓度又会随时间增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速加入的新鲜培养基流速相平衡，即可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，但能保持稳定菌体密度的菌体。1242023/3/28恒化法1252023/3/281262023/3/28

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微生物的连续培养1272023/3/28

恒浊与恒化培养控制装置1282023/3/28装置恒浊器恒化器控制对象菌体密度(内控制)培养基流速(外控制)培养基无限制生长因子有限制生长因子培养基流速不恒定恒定生长速率最高速率低于最高速率产物大量菌体或与菌体相平行的代谢产物不同生长速率的菌体应用范围生产为主实验室为主

Turbidostat&chemostat的比较1292023/3/28工作原理：培养液浊度与菌浓度成正比

限制性营养物与菌生长速度正比。

控制方法：改变流速，使培养液浊度恒定

流速恒定

流入培养基成分：各种营养成分都很充分

限制性营养物浓度低，其他成分充分。

容器内菌的生长速率：最大生长速率低于最大生长速率

恒浊器

恒化器1302023/3/28分批培养与连续培养的比较1312023/3/281322023/3/28

优点：自控性，利用各种仪表进行自动控制；高效，它使装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等工艺简化了，缩短了生产时间和提高了设备的利用效率；产品质量较稳定；节约大量动力、人力、水和蒸汽，水、电、气负荷减少。缺点：菌种易于退化容易污染，在连续发酵中，要保持各种设备无渗透，通气系统不出任何故障，是极其困难的。因此，“连续”培养有时间限制，一般可达到数月至一年、两年。连续培养中，营养物的利用率低于分批培养。应用：单细胞蛋白的生产，乙醇、乳酸、丙酮和石油脱蜡，污水处理。微生物的连续培养与连续发酵的特点1332023/3/28同步生长同步生长通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态；获得同步生长的方法环境条件诱导法机械筛选法1342023/3/28方法：⑴调整生理条件诱导同步性，主要是通过控制环境条件如温度、光线和处于稳定期的培养物添加新鲜培养基等来诱导同步。⑵机械法，它是利用物理方法从不同步的细菌群体中选择出同步的群体，一般地，诱导法不如选择法。注意：同步生长的细菌，在培养过程中会很快丧失其同步性。1352023/3/28同步培养方法机械方法环境条件控制技术离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法温度培养基成份控制光照和黑暗交替培养1362023/3/281372023/3/28硝酸纤维素滤膜法离心法1382023/3/28Helmstetter-Cummings法原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。1392023/3/281402023/3/281412023/3/285.2.3影响微生物生长的因素(1)温度影响微生物生长繁殖的最重要因素之一。就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在-10～95℃范围内生长。而对某一具体微生物而言，只能在一定的温度范围内生长，且此温度范围有宽、有窄。生长温度三基点：任何微生物的生长温度总有最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度。1422023/3/28（一般为-5~-10℃，极端为-30℃）指微生物能进行繁殖的最低温度界限。此时，微生物生长速度很低，如果低于此温度则生长完全停止。不同微生物最低生长温度不一样，这与它们的原生质物理状态化学组成有关，也可随环境条件而变。①最低生长温度1432023/3/28

指某菌分裂代时最短或生长速率最高时培养温度（嗜冷菌<20℃嗜中温菌20~45℃嗜热均>45℃），但是，同一微生物，不同生理生化过程有着不同最适温度，即最适生长温度并不等于生长量最高时培养温度，也不等于发酵速度最高时培养温度或累积代谢产物量最高时培养温度，更不等于积累某一代谢产物量最高时培养温度。因此，生产上要根据微生物不同生理代谢过程温度特点，采用分段式变温培养或发酵。②最适生长温度1442023/3/28

指微生物生长繁殖最高温度界限（一般为80~95℃，极端105~300℃），此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡。微生物所能适应最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。③最高生长温度1452023/3/28

最高生长温度如进一步升高，便可以杀死微生物，这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度。它与处理时间有关，处理时间越长，死亡率越高，严格地，一般应以10分钟为标准时间，细菌在10分钟被完全杀死的最低温度称为致死温度。④致死温度1462023/3/28

可在较低温度下生长，其适温10~15℃，常分布在地球两极地区水域和土壤中，即使在其微小的液态水间歇中也有微生物存在。（右图为南极Vostok湖冰芯样品中的微生物）⑤低温型微生物1472023/3/28嗜冷机制：①酶系在低温下仍能起催化作用②细胞膜含较多的不饱和脂肪酸，在低温下仍具有通透性。1482023/3/28

绝大多数微生物属于此类，最适生长温度在20~40℃间，最低生长温度10~20℃，最高生长温度40~45℃，又可分为嗜室温和嗜体温微生物。⑥中温型微生物1492023/3/28

适于在45℃以上温度中生长，在自然界中分布仅局限于某些地区，如温泉、日照充足的土壤表层、堆肥、发酵饲料等腐烂有机物中。⑦高温型微生物1502023/3/28

嗜热菌

它们适于在45～50℃以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限制于某些地区，如温泉、日照充足的土壤表面、堆肥堆、发酵饲料等腐烂有机物中，比如堆肥在发酵过程中温度常高达60～70℃。

嗜热机制：

①细胞内的酶具强抗热性。

②产生的多胺，热亚胺和高温精胺物质对蛋白质,等组织结构具有保护作用。

③核酸也具有热稳定性的保护结构。

④细胞膜含有较多的饱和脂肪酸和直链脂肪酸，使膜具有稳定性。1512023/3/28温度与典型微生物生长速率的关系1522023/3/28(2)干燥会造成微生物失水代谢停止以至死亡，不同微生物对干燥抵抗力是不一样的；抵抗干燥的能力，依次为细菌芽孢，霉菌和酵母菌孢子，革兰氏阳性球菌，酵母营养细胞，霉菌菌丝；影响微生物对干燥的抵抗力的因素：干燥时温度升高，微生物容易死亡，温度降低，抵抗力强。缓慢干燥，微生物容易死亡。快速干燥，微生物抵抗力强。1532023/3/28(3)渗透压大多微生物适于在等渗的环境生长，若置于高渗溶液(20%NaCl)中，易造成细胞脱水而引起质壁分离，使细胞不能生长甚至死亡，若置于低渗溶液中，外环境中水从溶液进入细胞内引起细胞膨胀，甚至破裂致死。1542023/3/28

一般微生物不耐高渗。食品工业可采取多种有效抑制微生物生长，保存食品的方法。有些微生物耐高渗能力较强，可在15—30%盐溶液生长。1552023/3/28(4)pH微生物生长pH范围较广，一般在2－8之间，绝大多数生长在pH5－9。不同的微生都有其最适生长pH和一定pH范围，即最高、最适与最低三个数值。最适pH范围内微生物生长繁殖速度快。最低、最高pH环境中，微生物虽能生存和生长，但缓慢且易死亡。1562023/3/28微生物根据最适pH的不同，可以分为三类

①嗜中性微生物(Neutrophiles)最适pH5-8.

②嗜酸微生物(Acidophiles)

最适pH<5

③嗜碱微生物(Alkaliphiles)最适pH>81572023/3/28一般地，霉菌适应环境范围最大，酵母菌较小，细菌最小。微生物最低pH最适pH最高pH细菌3~56.5~7.58~10酵母菌2~34.5~5.57~8霉菌1~34.5~5.57~81582023/3/28同一微生物在其不同的生长阶段和不同生理、生化过程中。也要求不同最适pH，这对发酵工业中pH控制，积累代谢产物特别重要。强酸、强碱都具有杀菌力。1592023/3/28微生物生命活动能改变外界环境pH，如

糖类－－－－－pH↓

有机物脂肪－－－－－pH↓培养基内蛋白质－－－－pH↑中性成分

(NH4)2SO4－－－－pH↓

无机盐

NaNO3－－－－-pH↑发酵、氧化水解脱羧NH4＋选择吸收NO3-选择吸收1602023/3/28

过酸时：加NaOH、Na2CO3等碱液中和

治标

过碱时：加H2SO4、HCl等酸液中和pH

调节

加适当氮源：加尿素、NaNO3、

过酸时

NH4OH或蛋白质等

治本

提高通气量

加适当碳源：加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂

过碱时

降低通气量1612023/3/28发酵工业中，及时地调整发酵液pH，有利于积累代谢产物，是生长中一项重要措施。pH治标治本过酸：加碱液中和过碱：加酸液中和过酸：过碱：加适量氮源加适量碳源1622023/3/28

专性好氧菌：要求必须在有分子氧条件下才能生长，有完整呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，绝大多数真菌和许多细菌都属此类。兼性厌氧菌：在有氧和无氧条件下都能生长，有氧情况生长良好，有氧时进行呼吸产能，无氧时进行发酵，细胞含SOD和过氧化氢酶，许多酵母菌，细菌属此类。(4)

氧气1632023/3/28

微好氧菌：只能在较低氧分压下才能正常生长的微生物，也通过呼吸链以氧为最终氢受体而产能。

耐氧菌：一类可在分子氧存在时进行厌氧呼吸的厌氧菌，即它们生长不需要氧，但分子氧存在对它也无毒害。它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量，细胞内存在SOD和过氧化物酶，但无过氧化氢酶，一般多数乳酸菌是耐氧菌。1642023/3/28厌氧菌：可分为一般厌氧菌和严格厌氧菌,分子氧存在对它们有毒，甚至死亡，它们在固体或半固体培养基表面上不能生长，只能在深层无氧或低氧化还原电势环境下生长，其生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供，细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶。1652023/3/28大多数还缺乏过氧化氢酶，常见厌氧菌有肉毒梭状芽孢杆菌、拟杆菌属、双歧杆菌属、光合细菌、产甲烷菌等。1662023/3/28氧与细菌生长的关系

1672023/3/28不同微生物在半固体琼脂柱中的生长状态a好氧菌b厌氧菌c兼性厌氧菌d微好氧菌e耐氧菌1682023/3/28二、氧气(oxygen)

好氧菌(Aerobes)1.专性好氧菌(obligateaerobes)

必须有氧存在2.兼性好氧菌(facultativeaerobes)

有氧无氧均可，但有氧更好3.微好氧菌(microaerophilicaerobes)

只在较低的氧分压下生长

厌氧菌(anaerobes)4.耐氧菌(aerotolerantanaerobes)

不需氧，但有氧也能生存，氧无毒害5.专性厌氧菌(obligate/strictanaerobes)

氧有毒害，甚至致死1692023/3/28厌氧菌的氧毒害机制

厌氧菌体内无SOD(超氧化物歧化酶)，因此受生物体内普遍存在的超氧阴离子自由基的毒害作用。1702023/3/28去除·O2-等有害活性氧分子的机制H2O+1/2O22H2O2·O2-+2H+H2O2+O2SOD一切好氧生物及耐氧菌过氧化氢酶一切好氧生物NADH2NAD过氧化物酶耐氧菌1712023/3/285.2.4有害微生物控制