淋巴细胞转化实验

淋巴细胞转化实验第一页，共二十三页，2022年，8月28日淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。原理第二页，共二十三页，2022年，8月28日T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可选择性刺激T细胞增殖；★脂多糖（LPS）可刺激B细胞增殖；第三页，共二十三页，2022年，8月28日分离人外周血单个核细胞（PBMC）分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术)淋巴细胞转化试验实验流程第四页，共二十三页，2022年，8月28日实验流程

－－PBMC的分离基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.075－1.090；Ficoll比重为1.077±0.001。将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。第五页，共二十三页，2022年，8月28日←ＰＢＭＣ←淋巴细胞分离液←红细胞、粒细胞、血小板←血浆第六页，共二十三页，2022年，8月28日实验流程

－－淋巴细胞转化实验基本原理：在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖；有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细胞发生增殖。第七页，共二十三页，2022年，8月28日形态计数法、MTT法、CCK-8法、同位素法。

（一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转化百分率。（二）MTT法：MTT是一种噻唑盐。活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经ＤＭＳＯ溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定OD570的值。实验流程

－－结果观察第八页，共二十三页，2022年，8月28日（四）3H-TdR掺入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准确性好。（三）CCK-8(CellCountingKit-8)法:原理同ＭＴＴ法。是ＭＴＴ的升级替代产品，可被还原成橙黄色的甲臜，且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，对细胞的毒性低。

实验流程

－－结果观察第九页，共二十三页，2022年，8月28日第十页，共二十三页，2022年，8月28日取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1）将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min将滴管（滴管2）插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，加入PBS（吸管1）至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞1次（吸管1）（滴管2）.离心之前计数细胞弃上清,加入完全培养基（吸管2）,重悬细胞（滴管2）.将细胞浓度调整为2*106个/ml.将细胞加入96孔板（加样枪）,100ul/孔A组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔.每个浓度为2复孔.留2个孔仅加入培养基，作为空白对照.

B组：加入100ulConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.4复孔.设空白对照.实验步骤第十一页，共二十三页，2022年，8月28日A组：置培养箱中培养66h,加入MTT溶液20ul/孔,继续培养6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,弃分混匀,测OD570nm值.

B组：置培养箱中培养66h，制备流式标本，上机检测第十二页，共二十三页，2022年，8月28日细胞数/ml＝4大格中细胞总数4×104

×稀释倍数第十三页，共二十三页，2022年，8月28日ConA的倍比稀释10ug/ml5ug/ml2.5ug/ml450µL440µL220µL220µLOriginalsampletubetube1tube2220µL第十四页，共二十三页，2022年，8月28日注意无菌操作操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数将稀释血加于分离液时，动作要轻柔离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车”档分离不同种属动物的PBMC要用不同的淋巴细胞分离液细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件注意事项第十五页，共二十三页，2022年，8月28日细胞培养技术第十六页，共二十三页，2022年，8月28日细胞培养概述细胞培养（cellculture）：从体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结构和功能的方法。细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能。第十七页，共二十三页，2022年，8月28日细胞培养实验的基本要求实验前准备：超净台紫外线消毒30min；无菌室每周消毒1-2次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用75%酒精擦拭。实验中要求：

Ω一切操作均要在火焰前方进行；瓶口、吸管使用前要经过火焰消毒后使用。

Ω试剂瓶的瓶口应斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口。

Ω专管专用。Ω手不要从敞开的瓶口上方经过。实验后要求：关闭超净台风机；用酒精纱布擦拭超净台台面，紫外线消毒。第十八页，共二十三页，2022年，8月28日细胞培养条件合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟合成。常用的培养基有RPMI-1640、DMEM、IMDM等。血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。常用青、链霉素；庆大霉素等。消化液（培养贴壁细胞用）：0.25%胰蛋白酶、EDTA液pH调整液

NaHCO3溶液：常用浓度为5.6%和7.4%Hepes液：可较长时间保持较强的缓冲作用培养条件：无菌、３７℃、５％ＣＯ２第十九页，共二十三页，2022年，8月28日细胞培养基本技术细胞原代培养：从供体获取组织细胞的首次培养。原代细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性。适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。细胞传代培养：原代培养细胞长到一定密度时，需进行传代培养。√悬浮生长细胞传代：离心法√半悬浮生长细胞传代：直接吹打法√贴壁生长细胞传代：胰酶消化法第二十页，共二十三页，2022年，8月28日细胞的冻存、复苏与运输细胞的冻存

10％DMSO（低温保护剂），20％以上的血清，其余为培养基，细胞数1×106个-1×107个。二步冻结法。细胞的复苏

从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入37℃水浴中充分摇动，使其迅速融化。加入培养液离心后，弃上清，加培养液培养。细胞的运输

长距离运输：补充培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖；瓶口用胶带密封，并用棉花包裹作防震、防压处理。第二十一页，共二十三页，2022年，8月28日细胞培养常见污染及处理方法