第二章基因工程制药

BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药基因工程制药GeneEngineeringforPharmaceutics

（四）BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药质粒的不稳定性分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药提高质粒稳定性的方法选择合适的宿主菌选择合适的载体选择压力分阶段控制培养控制培养条件固定化BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药第九节基因工程药物的分离纯化

基因工程药物或生物技术产品特点:(1)目的产物在初始原料中的含量较低;(2)含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药(3)目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；

种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质；

应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药一、建立分离纯化工艺的根据1、含目的产物的起始物料的特点利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药一、建立分离纯化工艺的根据（1）菌种类型及其代谢特性：（2）原材料和培养基的来源及其质量；（3）生产工艺和条件：（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药一、建立分离纯化工艺的根据2、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药一、建立分离纯化工艺的根据3、目的产物特性产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药一、建立分离纯化工艺的根据4、产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药二、分离纯化的基本过程

由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药

基因工程药物分离纯化的一般流程发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药三、分离纯化的技术1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；

2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；

3）收率要高；

4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；

5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药3-1、细胞破碎与固液分离

（1）细胞收集：离心和膜过滤（2）细胞破碎：机械法---高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。非机械法----酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。（3）固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和膜过滤。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药

表1产物的主要特性及在分离纯化中的作用产物特性作用

等电点决定离子交换的种类及条件

相对分子质量选择不同孔径及分级分离范围的介质

疏水性与疏水、反相介质结合的程度

特殊反应性产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制

聚合性是否采用预防聚合、解聚及分离去除聚合体

生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用的温度及流程时间微不均一性影响产物的回收3-2、目的产物的分离纯化

BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药

表2基因工程药物生产中常用的分离纯化方法

方法目的

离心/过滤去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质阴离子交换层析去除杂志蛋白、脂质、DNA、病毒

40nm微孔滤膜过滤进一步去除病毒阳离子交换层析去除牛血清蛋白或转铁蛋白等超滤去除沉淀物及病毒疏水层析去除残余的杂蛋白凝胶过滤与多聚体分离

0.22μm微孔滤膜过滤除菌BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药1）具有良好的稳定性和重复性；

2）尽可能减少组成工艺的步骤；

3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调，工艺和设备相适应。

4）在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤，或干扰产品质量；

3-3、分离纯化工艺应遵循的原则BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药5）分离纯化工艺所用的时间尽可能短，尤其是对稳定性差的产物；

6）工艺和技术必须高效，收率高，易操作，对设备条件要求低，能耗低；

7）具有较高的安全性。3-3、分离纯化工艺应遵循的原则BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药

层析(chromatography)离子交换层析(Ionexchangechromatography)疏水层析(Hydrophobicinteractionchromatography)亲和层析(Affinitychromatography)凝胶过滤层析(GelFiltrationchromatography)分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药Ionexchangechromatography离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换介质的选择原则BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药离子交换层析的基本原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药离子交换介质的基本性质离子交换剂离子交换剂，通常是一种不溶性高分子化合物如纤维素，葡聚糖，琼脂糖等；离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。↙共价结合平衡离子BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药离子交换剂的分类阳离子交换剂：强酸型和弱酸型可电离的基团磺酸基（-SO3H）磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COOH）酚羟基（-OH）阴离子交换剂：强碱型和弱碱型可电离的基团伯胺基（-NH2）仲胺基（-NHCH3

）叔胺基（-N(CH3)2）季胺基（-N+(CH3)3

）BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药常用的离子交换剂离子交换纤维素：离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。阳离子型离子交换纤维素:羟甲基纤维素（CM纤维素）等阴离子型离子交换纤维素:二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药常用的离子交换剂离子交换葡聚糖：是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（SephadexG）。常用的离子交换葡聚糖：

阳离子交换剂:CM-SephadexC-25/50

阴离子交换剂:DEAE-SephadexA-25/50

BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药常用的离子交换剂离子交换琼脂糖：是携带DEAE或CM基团的SepharoseCL-6BDEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药离子交换介质的选择原则一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离;碱性物质用阳离子交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质根据pI值及离子化曲线来选择BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药Hydrophobicinteractionchromatography疏水层析（HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药疏水配基烷基链配基芳基配基

高分子配基

BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药人工合成聚合物类琼脂糖纤维素聚苯乙烯聚丙烯酸甲酯类多糖类壳聚糖

疏水基质平衡Equilibration上样loading洗杂Washing洗脱Elution基本操作BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药Affinitychromatography利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。原理配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药亲和层析的特点：1.纯化过程简单、迅速，且分离效率高；2.特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子;3.纯化倍数大，产物纯度高;4.必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件,因此应用范围受到一定的限制。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药亲和层析配基的选择：纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力。但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药常用的亲和层析载体纤维素葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药GelFiltrationchromatography凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。凝胶层析的基本原理BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药葡聚糖凝胶（Sephadex）:种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。G表示葡聚糖，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克。G值越小，交联度越大，吸水性越小。琼脂糖凝胶:

由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose和Bio-Gel-A等。是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。聚丙烯酰胺凝胶:一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，