第八讲干细胞与iPS技术

LucasCranach,1472-1553第一页，共72页。自然界中生物的再生现象将涡虫切断后，断面能够识别头部或者尾部的位置，如果切掉的是头，头部将在该位置再生；如果切掉的是尾，尾巴将在该位置再生蝾螈的四肢、壁虎的尾巴都具有自然再生的能力青蛙与蝾螈同属两栖动物，却不具备再生的能力，但青蛙的前身蝌蚪却又显示出四肢再生的能力。

第二页，共72页。第三页，共72页。第四页，共72页。20世纪初，遗传学家ThomasMorgan利用涡虫（flatworm,Planaria）为材料研究过再生问题。研究表明切割下来的组织块小到涡虫虫体的1/279时仍然能够再生出一条小涡虫。因此,涡虫又被誉为“切不死的动物”。他将这个过程称为变形再生（morphallaxis）。再生组织是由伤口处已分化细胞的去分化衍生而来,还是来源于称为全能干细胞的neoblasts(未分化细胞),这是一个长期争论不休的问题。第五页，共72页。后来研究发现，在涡虫体内有一种散布在全身，好似没什么功能的非常小的细胞，它们就是干细胞。涡虫的干细胞能够转变成“其他任何种类的细胞”，具有这种性质的细胞在生物学上被称为“全能干细胞”。第六页，共72页。第一节干细胞

一、干细胞的定义

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。第七页，共72页。二.干细胞特性及分类

干细胞的特性：1，形态和生化特征:圆形、体积小、核质比例大，端粒酶活性高第八页，共72页。

2，干细胞的增殖特点

缓慢性：干细胞的增殖速度一般比较慢。而一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化。自稳性：会自我更新维持自身数目的恒定。（self-maintenance）干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂

第九页，共72页。

干细胞的对称分裂和不对称分裂对称分裂（symmetrydivision）不对称分裂（asymmetrydivision）干细胞

分化细胞

干细胞

分化细胞第十页，共72页。缓慢性干细胞若干次分裂过渡放大细胞是介于干细胞和分化细胞之间的中间态细胞。它可以起到通过较少的干细胞产生较多的分化细胞的作用。分化细胞过渡放大细胞第十一页，共72页。3，干细胞的分化特点

1）.多潜能性2）.去分化和转分化的能力第十二页，共72页。在不同生长因子刺激下干细胞可表现出不同分化潜能第十三页，共72页。（内胚层）

胃上皮（中胚层）

骨、软骨、平滑肌、横纹肌（外胚层）

神经表皮、神经节、复层鳞状上皮人胚胎干细胞具分化的多潜能性

小鼠皮下注射

混合组织瘤人胚胎干细胞第十四页，共72页。（1）去分化

一种干细胞向其前体细胞的逆向转化的过程。（2）转分化（transdifferentiation）

一种组织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种组织类型细胞的过程。

例一：将成年雄性小鼠的造血干细胞移植到雌鼠体内，3天后在雌鼠的神经胶质细胞中检测到Y染色体的存在，证明成体动物的造血干细胞可转分化成为神经胶质细胞。2）.去分化和转分化的能力第十五页，共72页。例二：造血干细胞向骨骼肌细胞的转分化第十六页，共72页。（二）干细胞的分离与纯化

1.通过干细胞表面的标记分子进行造血干细胞标记物为CD34＋等；神经干细胞的巢素蛋白。2.通过干细胞不同于一般分化细胞的物理特性进行

干细胞不被Hoechst33342和Rhodamine123染色。第十七页，共72页。三，干细胞的分类（1）全能干细胞：具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，并能进一步形成机体的任何组织和器官。以生殖干细胞（embryonicgermcells,EG细胞）为代表。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。以胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）为代表。（3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。第十八页，共72页。第十九页，共72页。第二十页，共72页。第二十一页，共72页。（一）胚胎干细胞

人体发生过程：受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞群中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统外胚层体表结构；神经系统第二十二页，共72页。胚胎干细胞的概念胚胎干细胞（embryonicstemcell,ES细胞）指从着床前的内细胞团或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。第二十三页，共72页。胚胎干细胞的生物学特性

(1)ES细胞形态结构与核型：

各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小、核大、有1个或多个核仁。

第二十四页，共72页。

(2)ES细胞的生长特性：对于高等脊椎动物而言，干细胞在机体组织中的居所被称为干细胞巢第二十五页，共72页。

(3)ES细胞高度分化潜能：ES细胞的全能性是区别于成纤维细胞等体细胞的特点。ES细胞体外生长时应该培养在饲养层细胞上才能维持其未分化状态，脱离饲养层就会自发地进行分化。第二十六页，共72页。增殖速度：18－24h分裂增殖一次ES必须在含有白血病抑制因子（LIF）的培养基及成纤维细胞饲养层(提供干细胞生长不可缺少的成纤维细胞生长因子FGF)条件下才能保持繁殖而不分化。

ES体外培养要解决的关键问题是维持细胞的分裂增殖而抑止其分化。具有分化形成外、中、内三个胚层的潜能。第二十七页，共72页。（三）人胚胎干细胞的来源与鉴定

HumanEmbryonicStemCell

胚胎干细胞的来源为早期胚胎内细胞群或原始生殖细胞。哺乳动物早期胚胎的发育属于调整型，每个胚胎细胞都具有全能性。第二十八页，共72页。a.取自体外受精胚胎囊胚期内细胞群。

Thomson法1.来源

第二十九页，共72页。b.取自终止妊娠的胎儿的性器官组织。

Gearhart法第三十页，共72页。c.通过体细胞核转移技术（克隆技术）获得第三十一页，共72页。2.克隆技术克隆是英文clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。第三十二页，共72页。先前一直认为，高等动物的细胞分化是一个不可逆的过程，因此无法利用已分化的动物细胞进行克隆的。英国剑桥大学的约翰•戈登教授首先通过实验研究从理论上证明了动物细胞重新编程是完全有可能的，1962年，他通过实验把青蛙肠上皮的细胞的细胞核移植进入去掉核的卵母细胞质中，并培育出成体青蛙。这一实验首次证实分化了的细胞基因组是可以逆转变化的，具有划时代的意义，并且为动物克隆实验奠定了基础，大名鼎鼎的克隆羊多利就是依照戈登所创造的方法被克隆出来的。第三十三页，共72页。克隆羊Dolly的诞生1996年7月5日，位于苏格兰爱丁堡市郊的罗斯林研究所里诞生了一头大个头儿羊羔，实验室编号为6LL3，克隆羊项目小组主管伊恩·威尔默特以著名乡村歌手多利·帕顿的名字命名这头羊。多利于1997年首次公开亮相，震动整个世界，美国《科学》杂志把多利的诞生评为当年世界十大科技进步的第一项。第三十四页，共72页。第三十五页，共72页。第三十六页，共72页。哺乳动物克隆技术的发展克隆羊：1996年7月，苏格兰克隆鼠：1997年10月，日、美、英克隆牛：1998年7月，日本克隆猫：2002年2月，美国克隆狗：2005年4月，韩国，黄禹锡克隆恒河猴：2007年11月，美国

第三十七页，共72页。轰动世界的黄禹锡造假事件2004年2月黄禹锡在《科学》杂志上发表论文，宣布在世界上率先用卵子成功培育出人类胚胎干细胞；2005年5月，他又在《科学》杂志上发表论文，宣布攻克了利用患者体细胞克隆胚胎干细胞的科学难题，其研究成果一时轰动全球。2005年4月黄禹锡在《自然》杂志上发表论文，成功实现了狗的克隆。“斯纳皮”正是世界上第一条克隆狗。

第三十八页，共72页。2006年1月首尔大学调查委员会公布了造假事件调查结果，称发表在science上的两篇论文都属于造假。克隆狗的那篇论文被证明是可信的。首尔大学随后宣布解除黄禹锡的教授职务，韩国政府也取消了授予黄禹锡的“最高科学家”称号。第三十九页，共72页。黄禹锡东山再起2010年10月17日，黄禹锡及其团队宣布利用狗的卵子，成功异种克隆了８只郊狼。2012年3月13日，黄禹锡与俄罗斯研究人员13日签署合作协议，打算利用克隆技术复活大约1万年前灭绝的史前生物猛犸象。第四十页，共72页。克隆人？第四十一页，共72页。a

胚胎干细胞具有正常稳定的二倍体核型和带型。b胚胎干细胞具有较高的端粒酶活性及碱性磷酸酶的表达。

人胚胎干细胞系端粒酶活性都很高，说明其可在体外未分化状态进行长期培养。3.胚胎干细胞的鉴定第四十二页，共72页。c.人胚胎干细胞特异表面抗原的表达

胚胎阶段特异性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分离的hES阴性弱阳性强阳性Gearhart分离的hES阳性弱阳性阳性小鼠ES阳性阴性阴性鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。Gearhart等认为SSEA-1阳性可能是源于原始生殖细胞的多能干细胞分化的标志.细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81第四十三页，共72页。d.具有转录因子Oct-4的表达

Oct-4只限定在多潜能细胞中表达。人和小鼠的胚胎干细胞都表达转录因子Oct-4，当胚胎干细胞分化时，其表达能力大大降低。Oct-4可能是哺乳动物不同发育阶段多潜能细胞所特有的少数特异的调控分子之一。第四十四页，共72页。

e.不被Hoechst33342和Rhodamine123染色f.能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤g.可诱导分化为各种成体干细胞第四十五页，共72页。胚胎干细胞的诱导分化：胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－造血细胞 RA胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－神经细胞DMSO胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－肌肉细胞TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－血管和内皮细胞RA+胰岛素+T3胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－脂肪细胞BMP-2,BMP-4胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－软骨细胞地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－－骨细胞基因转染胚胎干细胞－－－－－－－－－－－－－－胰岛素分泌细胞第四十六页，共72页。（二）成体干细胞

成体干细胞是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。

在成体组织或器官中，许多细胞自我更新及分化产生不同组织细胞的能力，如血液和皮肤细胞。第四十七页，共72页。科学家鉴定或分离出多种成体组织的干细胞，造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞等等。由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。随着干细胞研究领域向深度和广度不断扩展，人们对干细胞的了解也将更加全面。

第四十八页，共72页。实际上，克隆羊Dolly的诞生就已经证明，通过体细胞核移植实验实现哺乳动物体细胞的重编程是可能的，将已分化细胞的细胞核植入卵细胞内可以使已分化细胞基因组中处于沉默状态的基因再次被激活，形成多能干细胞，最终发育形成一个新的完整的生命体。重编程的体细胞几乎能够实现对胚胎干细胞的替代。但是，体细胞核移植试验具有很大的局限性：1.克隆的效率极低2.产生的许多后代在各个阶段都体现出严重的发育异常3.由于需要卵母细胞，核移植实验在人类中的应用受到强烈的伦理学质疑。

第四十九页，共72页。有没有相对简单，又可摆脱材料来源和伦理学诸多限制，重编程的效率和程度都十分可观的新方法呢？50第五十页，共72页。第二节iPS技术概念：iPS，诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPScells）iPS技术，即诱导多能干细胞技术，也称细胞重新编程技术，是在特定的条件下将成体成熟、分化的体细胞逆转恢复到全能分化的状态，成为一类类似胚胎干细胞（多能干细胞）的新兴技术。2009年，iPS技术荣膺《自然-方法》年度生命科学技术。

第五十一页，共72页。iPS技术的诞生

2006年8月，日本京都大学的山中伸弥（ShinyaYamanaka)教授领导的研究团队发现，只需要将四个基因(Oct3/4,Sox2,c-myc和Klf4)送入已分化完全的小鼠纤维母细胞，即可以把纤维母细胞重新编排变成全能性的类胚胎干细胞。他们将这种”返老还童”的重新编排细胞称之为”诱导式多能性干细胞”，即iPS细胞。山中伸弥教授

ShinyaYamanakahttp://qnet.nishinippon.co.jp/InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicandAdult

FibroblastCulturesbyDefinedFactors.Yamanaka,S.,Takahashi,K.Cell126,663–676,August25,2006第五十二页，共72页。2007年11月20日，美国的Thomson实验室在science上发表文章，第一次成功地由人类的体细胞诱导为IPS细胞。他们从14个保持人类ES细胞多能性状态的基因筛选出四个基因OCT3/4,SOX2,NANOG,andLIN28，将之用慢病毒载体转入人类体细胞中，得到了在增殖能力、，形态学，核型，端粒酶活性，细胞表面标志，ES特征基因表达，畸胎瘤拟胚体形成能力上与人类ES相似的IPS细胞。InducedPluripotentStemCellLinesDerivedfromHumanSomaticCells.JUNYINGYU,MaximA.Vodyanik,JamesA.Thomson,SCIENCE21December2007:Vol.318.no.5858,pp.1917-1920第五十三页，共72页。2007年11月20日，日本Yamanaka实验室在CELL上发表了用人类的成纤维细胞（皮肤成纤维细胞，成纤维细胞样滑膜细胞，BJ细胞），通过逆转录病毒载体导入Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc四个基因，也成功得到了人类的IPS细胞，并证明它们在形态学，核型，端粒酶活性，细胞表面标志，ES特征基因表达，畸胎瘤拟胚体形成方面与ES细胞相似。同时，他们还成功的将这些IPS细胞诱导成神经细胞，心肌细胞。在这次实验中，他们通过对MEF引入了小鼠的你转录位点，提高了转到率。

InductionofPluripotentStemCellsfromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactorsYamanaka,S.,Takahashi,K.Cell131,861–872,November30,2007iPS被《自然》和《科学》杂志评为2007年第一和第二大科学进展。

第五十四页，共72页。诱导iPS细胞四个基因的选择体细胞可藉由将核送入卵中或是和胚胎干细胞核融合而被重建(Cowanetal.,2005;Tadaetal.,2001)必定有某些基因将细胞维持在多能性的状态胚胎细胞中：Oct3/4、Sox2、Nanog(Nicholsetal.,1998;Niwaetal.,2000;Avilionetal.,2003;Chambersetal.,2003;Mitsuietal.,2003)癌细胞中：Stat3、E-Ras、c-myc、Klf4、b-catenin

(Matsudaetal.,1999;Niwaetal.,1998;Takahashietal.,2003;Cartwrightetal.,2005;Lietal.,2005;Kielmanetal.,2002;Satoetal.,2004)4/24：Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4iPScell：inducedpluripotentstemcell第五十五页，共72页。材料：HDF-Slc7a1高加索36岁女性脸部皮肤0天：转入基因Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf46天：放置于mytomycinC-treatedSNLfeedercell中(5×104~5×105)7天：置換成干细胞专用培养液实验材料及诱导方案0天转染10%FBSESmedium+bFGF6天30天培养于feeder上收取colony第五十六页，共72页。B、HDF形态D、25天后形成颗粒状群落(与hES形态相似)C、14天后形成之颗粒状群落重建人类体细胞-产生iPS第五十七页，共72页。从顆粒狀群落中挑出类似hES细胞的群落：7/122，8/84，8/171，5/73，6/122，11/213发育成紧密堆叠且扁平状的群落类似hES：细胞核大、細胞质少会自发性分化需要feedercell才可生存圖E、培養出的iPS細胞型態图F、放大后的iPS細胞图G、iPS細胞群落中間自发性分化的細胞重建人类体细胞-产生iPS第五十八页，共72页。iPS细胞检测-hESmarker表现stage-specificembryonicantigen-1(SSEA-1)Sell-specificsurfaceantigens(Adewumietal.,2007)第五十九页，共72页。iPS细胞检测-hESmarker表现RT-PCR：iPS表现hESmarkerES：胚胎干细胞NTRA-2：人类胚胎瘤细胞HDF：人类真皮纤维母细胞图一、RT-PCR分析hESmarker基因表现结果第六十页，共72页。iPS细胞检测-hESmarker表现Westernblotting：

OCT3/4、SOX2、NANOG、SALL4、E-CADHERIN、hTERT(Adewumietal.,2007)

蛋白质表达量和hES细胞相似ES：胚胎干细胞NTRA-2：人类胚胎瘤细胞HDF：人类真皮纤维母细胞图二、hESmarker的westernblot分析第六十一页，共72页。端粒酶活性测试胚胎干细胞会高度表达hTERT基因-：实验组+：加热抑制端粒酶活性(阴性对照)IC：internalcontrol图三、用TRAP法测试trlomerase活性第六十二页，共72页。iPS细胞培养为类胚胎体将iPS细胞放入悬浮的培养液中生长8天后形成球状的类胚胎体(embryoidbodies,EBs)将类胚胎体置于覆蓋gelatin的培养基中生长8天iPScells附著于培养基上并分化成各种细胞形态第六十三页，共72页。类胚胎体的分化可在invitro的状态下将iPS细胞分化成三种胚层似神经元细胞表皮细胞