第15章 色谱法引论

第十五章色谱分析法Chromatography最早色谱装置图植物学家茨维特1906色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。15-1概述在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱

。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。色谱法实质上是一种物理化学分离分析方法，它又称为色层法或层析法．它是利用不同物质在两相（固定相和流动相）中具有不同的分配系数或吸附能力及其它亲和作用性能的差异为分离依据，当混合物中各组分随流动相移动时，在两相中反复进行多次分配，从而使各组分得到分离．概述色谱法分类1.按流动相不同分类(两相状态)

气体为流动相的色谱称为气相色谱(GC)．液体为流动相的色谱称液相色谱(LC)．超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱(SFC)．2．按分离机理分类

利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法．利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法．

利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法．利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法．

3．按固定相形状不同分类①柱色谱——固定相装在柱管内．它又可分为填充柱色谱和空心毛细管色谱．②纸色谱——利用滤纸作为固定相，样品溶液在纸上展开进行分离．③薄层色谱——以涂在玻璃板上或塑料板上的吸附剂粉末作为固定相，样品在板上展开进行分离．

色谱法和其它分析方法比较1色谱法与经典的化学分析法比较2色谱法与光谱、质谱分析法比较3色谱法与分馏法比较4色谱法与经典的物理化学常数测定方法比较色谱学理论研究的三个问题①色谱过程的热力学问题，是发展高选择性色谱柱的理论基础．②色谱过程的动力学研究，是发展高效能色谱柱与高效能色谱方法的理论基础．③色谱分离条件的选择是色谱学理论研究的第三个问题，这个问题的研究是多元混合物分离的理论基础．

15-2色谱分离过程及色谱常用术语一、色谱分离过程(流出曲线和色谱峰)

下面以A、B两组分的混合物在色谱柱中的分离过程来描述不同组分在柱中的分离，其分离过程如图15-1所示．图15-1色谱分离过程示意图

Link

二、气相色谱常用术语

色谱峰——组分从色谱柱中流出时，检测器响应讯号大小随时间变化所形成的峰形曲线叫作色谱峰（图15-2）．基线——色谱柱中仅有载气通过时，检测器响应讯号的记录应为一条直线(图15-2)，称为基线，基线反映仪器的噪声随时间的变化情况．峰高——色谱峰最高点与基线之间的距离称为峰高h（图15-2中AB）．图15-2色谱流出曲线Link区域宽度

色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素．度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：峰宽度——自色谱峰的拐点所作的切线在基线上的截距叫峰宽度（图15-2中Wb

）．半峰宽度－－峰高一半处色谱峰的宽度叫半峰宽度W1/2（图15-2中GH）．标准偏差σ——当进样量较小时，色谱峰呈高斯分布曲线形状，可用标准偏差来表示它的区域宽度，标准偏差σ即峰高0.607倍处色谱峰宽度的一半(图15-2中F1/2)．峰宽Wb，半峰宽W1/2及标准偏差σ之间的关系为：Wb＝4σ

W1/2＝2.354σ保留时间与保留体积从进样开始到某一组分色谱峰顶点所需的时间间隔称为该组分的保留时间（图15-2中的tr），其相应通过的载气体积称为该组分的保留体积Vr．某组分的保留体积即为它的保留时间与载气流速Fc的乘积．Vr=trFc死时间与死体积不被固定相吸附或溶解的组分(如空气或甲烷)从进入色谱柱到出现其色谱峰最高点所需的时间称为死时间（图15-2中OA)．死时间也是气体流经色谱柱中空隙(颗粒间、管路接头、检测器)所需的时间，其相应通过的载气体积为死体积V0，死体积V0为死时间t0与载气流速Fc的乘积．V0=t0Fc校正保留时间与校正保留体积扣除死时间以后的保留时间（图15-2中AB段）即校正保留时间tr，扣除死体积后的保留体积即校正保留体积Vr．

tr=tr–t0

Vr=Vr–V0相对保留值在相同操作条件下，某组分的校正保留值（t’r2或V’r2）与另一组分的校正保留值（r’r1或V’r1）的比值，称为相对保留值．(15-1)

由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据．必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比.从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。15-3色谱法基本原理热力学动力学一、分配系数与分配比—热力学色谱过程热力学就是从热力学和统计力学的观点出发，研究溶质保留值随分析条件、分子结构变化的规律。组分要达到完全分离，两峰间距离必须足够远，这一距离是由组分在两相间的分配系数决定的，因此与色谱过程热力学有关。

1.分配系数K

分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次的吸附-脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。分配系数——在一定温度、压力下，气－液两相间达到平衡时，组分在固定相与流动相中的浓度比，称为分配系数(K)，也叫平衡常数．

K=Cs/Cm

（15-2）式中：cs——组分在液相中的浓度(g·mL-1)cm——组分在气相中的浓度(g·mL-1)分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：固定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。2.分配比k

分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。分配比——分配比是在一定温度、压力下，气液两相间达到平衡时，组分在固定相与流动相中分配的质量比．分配比又称容量比或容量因子．

k=ms/mm

（15-3）式中：k——分配比,ms——组分在固定相中的质量,mm——组分在流动相中的质量k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。

k=ms/mm=CsVS/CmVm

式中cs,cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。分配比k值可直接从色谱图中测得（推导过程教材P.296~297）。

k=(tr–t0)/t0=tr/t0=Vr/V0

3.分配系数K与分配比k有如下关系：（推导过程教材P.297）K=k.

其中β称为相比率，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6~35；对毛细管柱，其β值为60~600。4.分配系数K及分配比k

与选择因子α的关系

对A、B两组分的选择因子，用下式表示：

α=tr(B)/tr(A)=k（A）/k（B）=K（A）/K（B）通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则α=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。下图是A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。

溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓第一，两组分的分配系数必须有差异；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。图中KA>KB，因此，A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。15-3色谱法基本原理二、塔板理论把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，简称板高。1.在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。3.所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4.分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。塔板理论假设：塔板理论应用：1.流出曲线形状的解释图15.2组分从n=5柱中的流出曲线图

m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数．当V=Vr

时，C值最大，即由塔板理论可建流出曲线方程：

塔板理论应用：2.导出理论板数与峰宽的关系而理论塔板高度（H）即：由流出曲线方程可推出从上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高．因此，n和H是描述柱效能的指标．通常填充色谱柱的n＞103，H＜1mm．而毛细管柱n=105~106，H＜0.5mm.第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值一般很大，如气相色谱柱的n约为103~106

，而毛细管柱n=105~106。因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。由塔板理论得出：第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：式中tr

与W1/2(W)应采用同一单位（时间或距离）。从公式可以看出，在tr

一定时，如果色谱峰很窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。

在实际工作中，由公式:n=L/H和n=5.54(tr/W1/2)2=16(tr/W)2

计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用tr计算时，没有扣除死时间t0，所以常用有效塔板数n有效表示柱效：

n有效:有效板高：这是因为，在相同的色谱条件下，对不同的物质计算的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么物质进行测量。例已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。解：n=16(tR/W)2=16(400/40)2

=1600块说明：塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数。塔板理论并不完全符合色谱柱内的实际分离过程，实际上，载气和组分在柱内的移动是连续的而不是跳跃式的一次移动一个塔板，也不是在一个塔板高度内达成平衡而是柱内处处平衡，但是因为这个比喻形象简明，能说明一些问题，因此一直被采用。但是，色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。15-3色谱法基本原理三、速率理论—色谱过程动力学

色谱过程动力学研究物质在色谱过程中的运动规律，如解释色谱流出曲线的形状、谱带展宽的机理，从而为选择色谱分离条件提供理论指导。用严格的数学公式表述色谱理论需要根据溶质在柱内的迁移过程及影响这一过程的各种因素，列出相应的偏微分方程组，求出描述色谱谱带运动的方程式。其数学处理相当复杂，方程组的求解也非常困难。在实际研究中，通常要进行适当的条件假设并作简化的数学处理。在此仅作简单介绍。

1956年荷兰学者vanDeemter等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论——速率理论．他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素．该理论模型对气相、液相色谱都适用．

VanDeemter方程的数学简化式为

式中u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数．其中Ａ、Ｂ、Ｃ各项的物理意义如下．1．涡流扩散项A在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散，形象地如下图所示．

色谱柱中的涡流扩散由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：A＝2λdpA＝2λdp

上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速变和组分性质无关．为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的．对于空心毛细管，不存在涡流扩散．因此A＝0．

2.分子扩散项B/u（纵向扩散项）

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的．组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状．如下图所示．它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽．纵向分子扩散使峰变宽分子扩散项系数为

B＝2γDg

式中γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况．Dg为组分在流动相中扩散系数（cm2·s-1）．

3．传质阻力项Cu

由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论之（l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即

C＝Cg＋Cl

气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程．这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配．有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气相．这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽．对于填充柱，气相传质阻力系数Cg为式中k为容量因子．由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数成反比．因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可使Cg减小，提高柱效．液相传质阻力系数Cl为由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数Dl大，则液相传质阻力就小．降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使Cl增大．

当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离．虽然提高柱温可增大Dl，但会使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱温．

将上面式总结，即可得气液色谱速率板高方程这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响．

（2）对于液液分配色谱，传质阻力系数(C)包含流动相传质阻力系数(Cm)和固定相传质系数(Cs)，即

C＝Cm＋Cs

其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即

式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力．当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀.ωm是由柱和填充的性质决定的因子．ωsm是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关．液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs）可用下式表示：

综上所述，对液液色谱的VanDeemter方程式可表达为：该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项．

4．流动相线速度对板高的影响

（1）LC和GC的H－u图表明，对于一定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板高越小．但究竟控制怎样的线速度，才能达到最小板高呢？根据vanDeemter公式分别作LC和GC的H－u图，见下图．LC(a)和GC(b)的H~u图由图不难看出：LC和GC的H~u图十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；LC板高极小值比GC的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得多．LC的板高最低点相应流速比起GC的流速亦小一个数量级，说明对于LC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高．

5．固定相粒度大小对板高的影响上图中固定相粒度对板高的影响是至关重要的．实验表明不同粒度，H－u曲线也不同：粒度越细，板高越小，并且受线速度影响亦小．这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据．当然，固定相颗粒愈细，柱流速愈慢．只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求．15-4分离度柱效和选择性理论塔板数是衡量柱效的指标，它反映了色谱分离过程的动力学性质．在色谱法中，常用色谱图上两峰间的距离衡量色谱柱的选择性，其距离越大说明柱子的选择性越好．一般用选择因子a表示两组分在给定柱子上的选择性．柱子的选择性主要取决于组分在固定相上的热力学性质．下图说明了柱效和选择性对分离的影响．图（a）中两色谱峰距离近并且峰形宽．两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差．图（b）中虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低．图（c）中分离最理想，说明选择性好，柱效也高．

柱效和选择性对分离的影响由此可见，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引人一个综合性指标——分离度R．分离度（又称分辨率）是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标．

分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰峰宽平均值的比值，即

R值越大，表明相邻两组分分离越好．一般说，当R＜1时，两峰有部分重叠；当R＝1时，分离程度可达98％，认为两峰基本分离；当R=1.5时，分离程度可达99.7％．通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志．下图表示了不同分离度时色谱峰分离的程度．15-5基