天然产物制备技术戴富宝

天然产物制备技术戴富宝第1页/共49页制备色谱所谓制备色谱是指待分离的样品数量在g与g之间，分为分析型、半制备、制备型三种。第2页/共49页制备色谱对于制备型高压液相色谱分类方法有不同观点：例如对于高压液相色谱snyder和kirkland（1979）根据色谱柱能分离样品的量将其分为分析型（多孔型吸附剂，1～2mg，15min可分开两个分辨率Rs＝1.25的化合物，回收纯度>99%）,半制备型（100～200mg）和制备型（0.5～1.0g）三种。还可增加生产型色谱，即指那些样品量在几百克到几千克之间的分离。Herbert（1991）限定制备型色谱为样品量在克数量级，柱直径在25～150mm之间的分离，而生产型色谱为所用柱直径大于150mm的分离。所以对制备型一词范围，分离样品量之间存在显著的差别。第3页/共49页制备色谱选择制备型分离系统时，不仅仅要考虑待分离样品的量，还应考虑拟进行的分离的种类。充分考虑上述因素并正确选择色谱柱、尺寸、固定相种类以及流动相流速等参数才能保证分离和制备的成功。根据以往工作经验，往往采用两个步骤来完成分离工作，选用低分辨率、快速分析柱进行粗分（其中可除去色素、鞣质等杂质）再用HPLC高分辨率色谱柱进行细分。第4页/共49页一、基本原理液相色谱的效能取决于分离速度和分辨率，对于制备型加压液相色谱而言，上样量是一个重要指标。分辨率速度载样量第5页/共49页基本原理对于某个分离参数进行优化，往往会影响其它分离参数，例如：增加洗脱液流速会降低分辨率（Rs），分辨率会因上样量过大而下降，上样量过大的原因包括样品溶液的体积过大或浓度过大，色谱柱的载样量又取决于柱的直径、长度、固定相颗粒大小以及装填的紧密程度。对于偶尔的一次分离而言，其主要的目的是得到一定量的某个化合物，达到一定纯度和回收率。而对于生产规模的色谱分离而言，单位时间内可分离的样品量是一个关键指标，单位时间获得样品量即产量，取决于色谱柱直径和洗脱液流速等参数，生产能力和样品纯度是两个相互矛盾的因素，也就是说分辨能力并不是制备液相色谱考虑的首要因素。制备液相色谱应首先具有经济快速地生产所需产品的能力。第6页/共49页加压液相色谱中可发挥下列两方面的作用（a和b）或其中之一：a、加快洗脱液流速，提高分离速度，因为敏感化合物在长时间色谱分离时，其结构可能会发生变化，缩短分析时间最大优点在于避免这种变化。b、允许在分离过程中使用颗粒度更小的固定相，获得更高分辨率。微克级至毫克级样品一般用于波谱测试确定结构毫克级样品可用于进一步的结构鉴定，化学反应和某些生物活性测试，克数量级样品可用于进一步生物活性测试、药理、毒理实验，作为合成或半合成工作原料及标准品。此外，所介绍的制备液相色谱技术也可用于分离超纯标准品，标记化合物，痕量杂质，药物分解产物及代谢产物，还可用于生物高分子（蛋白质、多糖等）及多肽类化合物的分离。第7页/共49页二、分离方法的建立和优化第8页/共49页为选择制备型加压液相色谱的分离条件可采用下列操作步骤：选择液相色谱系统。在某些情况下，可以薄层色谱分析来初步确定分离条件（Heyward和munro,1980），即用硅胶薄层来确定正相柱条件，用反相硅胶薄层来确定反相柱条件。当选择该方法时，要牢记薄层色谱中硅胶的表面积是柱色谱中硅胶表面积的两倍，所选的展开剂条件应使样品Rf值不大于0.3少量样品在分析型液相色谱柱上的分离。在找到适当的薄层色谱分离的展开条件后，应将该条件转用于分析型液相色谱。利用这种初步的分析来获得正确分离条件的方法可以节省时间、样品和溶剂。第9页/共49页操作步骤优化分析型液相色谱条件，应寻求较小容量因子（K’），其理由在于分析型液相色谱洗脱剂系统转换为制备型液相色谱系统时，经常导致分离效能（分离度）下降。小的容量因子意味着分离时间缩短和出峰体积缩小。良好的分析型液相色谱分离通常是成功进行制备型液相色谱分离的先决条件。在找到分析型液相色谱分离条件后，通常将分离度调至高于分析型色谱所需水平。这样可以与制备型色谱分离过程中的过载相适应（图5.3）。在进行反相液相色谱分离时，增加溶剂系统中水的含量可达到这一目的。第10页/共49页操作步骤第11页/共49页操作步骤转换至制备液相色谱系统。（Gareil1982b；Cox1988）将分析型液相色谱条件直接用于制备型液相色谱分离时，所用压力应为分析型色谱的三分之一左右（Johnson1978）。Bidlingmeyer（1987）详细介绍了经过薄层色谱→分析型高压液相色谱→制备型高压液相色谱，来选择分离条件的方法。近期出现一种趋势，将分析型大小填料直接用于制备型液相色谱柱，这将无需对流动相作较大的改变。Waters公司生产的Symmetry系列柱（内装100Ā）球形填料，即是这种色谱柱的代表。第12页/共49页操作步骤纯化物质的回收。所得物质的分析，可以薄层色谱或分析型高压液相色谱进分离物质进行纯度和定性分析。分离结束后，可采用如下程序洗脱色谱柱（Simpson,1982）。正相柱：丙酮→水→甲醇→丙酮→四氢呋喃→二氯甲烷。反相柱：甲醇：四氢呋喃（1：1）或用纯甲醇冲。第13页/共49页三、色谱柱制备型加压液相色谱系统的关键部件是色谱柱。所选用色谱柱大小应取决于待分离样品的量（Hupe1981；Verzele1988）。几种经典色谱柱的直径和上样量的关系列于表5.1中。第14页/共49页色谱柱色谱柱的其它一些参数对于分离的成功也至关重要（图5.4）。影响分辨率Rs的主要参数是选择性α和容量因子k’，增大α值（选择性或相对保留时间）对分离的成功非常主要。第15页/共49页色谱柱增大柱的直径意味着可以承载更多样品、增加产量。增加色谱柱长度，意味着可以加入样品量和分辨率增大。半制备色谱柱我们认为Bondepak10m（3.9x300mm）色谱柱效能较佳。当时天然药化教研室做了七个研究生，得了好几个大奖，立下了汗马功劳。第16页/共49页四、固定相常用固定相可分为液－固（吸附），例如硅胶、氨基、二乙醇等液－液和C18,C8,C4键合相等，凝胶和离子交换，前者为排阻色谱，后者为阳离子、阴离子交换色谱（强酸、弱酸、强碱、弱碱等）另外还有NH2柱等。选择固定相应注意以下几点：颗粒大小及其孔径色谱柱长度操作压力第17页/共49页固定相第18页/共49页固定相恰当地综合考虑上述因素，才能得到好的分离效果。增加色谱柱长度可提高分辨率，但需施加更大压力，减少固定相颗粒，增加分离度，样品载样量但增加操作压力。一般来说，球形颗粒优于不规则形状颗粒。它具有较高机械强度，不易破碎，装柱重现性好，可增加样品在柱中的渗透性，峰对称较好、寿命长等优点。但球形固定相价格较高。柱层析颗粒在40－63m较易于干法装柱，载样量大，价格适中，能进行有效分离，最适宜颗粒大约为15m左右，颗粒减小增加N,Rs，但装柱时需更高压力。HPLC系统中颗粒大小为10m，5m，3m，1.8m等，其分离度好，易于纯化样品，对众多天然药物样品分离、纯化和制备是一条较好途径。第19页/共49页五、装柱方法装柱方法一般来说，颗粒度大，干法（顿击法）装柱（20－30m），小于此颗粒装柱较困难，一般采用湿法装柱（即匀浆装柱）。匀浆装柱需一个高压装置、匀浆罐、与填料比重相近溶剂（二氧六环、四氯化碳），其方法根据柱子内径和长度算出装填量，加入溶剂，超声，使成均匀匀浆（近透明），将柱子上螺丝卸下（经清洗、烘干、干净空柱），连到匀浆罐，然后将匀浆到入匀浆罐，拧紧灌盖，连接气动泵螺丝，一瞬间压下匀浆（400公斤），匀浆中溶剂经柱子从柱下口滤网快速滤出，而填料均匀下沉至柱中，再补打一次高压（400公斤），放置半小时直到打紧为止。柱装好后，放入高效液相色谱仪测试柱效和分离度，柱子即制备完成。以上是装分析柱方法，制备柱也可用同法装柱。第20页/共49页六、加样在将样品加到制备柱之前，需考虑以下因素：样品的制备方法；溶剂样品的溶剂；样品重量；样品体积；上样方法；色谱柱。第21页/共49页加样通常应尽可能选用流动相来溶解样品，样品在流动相中要有良好的溶解度。如果样品体积太大，分辨能力就会下降；另一方面，如果样品过浓，则有可能在柱顶部形成沉淀，压力飙升而停泵。为了每次能得到更多的样品，还是应在小体积的流动相中溶解较多的样品。将成功的分析型分离放大为制备型分离时，可能会遇到样品的溶解度问题。对于一些在水中难溶的样品，在进行反相HPLC分离时，就经常遇到上述问题。例如植物毛兜铃根部的粗提物在甲醇－水系统中溶解度差，为从提取物中获得马兜铃酸，在HPLC分离前，先将样品溶于甲醇－四氢呋喃1:1的溶液中。第22页/共49页加样量如何放大当分析规模的分离优化后，就要研究在分析柱上的上样量，以确定某种填料的容量。因为大规模的分离应该与小规模的分离相同，所以样品最大上样量将取决于分析规模分离的复杂程度要决定待纯化或分离的样品含量是多少需要纯化的样品含量一旦确定后，可以用简单的方程式求出纯化所需色谱柱的大小第23页/共49页不同规格柱上样品量应用求得的放大因子乘以分析型柱的上样量，以预测大直径柱的上样量。表1列出了常用不同规格柱上样品量的指南。第24页/共49页很多因素可影响制备柱的容量。下列一些影响因素需加以考虑：保留值大的物质容量高样品混合物简单容量高（例如商陆皂苷甲、乙、丙、丁……）梯度分离比等度分离时容量要高分离度要求越高，容量越低上样体积会限制容量大小样品的溶解度会限制容量大小选择不同的样品溶剂也会影响容量大小第25页/共49页以3.9×150mm色谱柱放大到19×150mm色谱柱的情况举例：用放大因子可以预测大柱上（填充柱与分析柱内装相同的填料）大约可负载24～142mg样品，此范围是根据分析柱（内径3.9mm）负载量1～6mg由放大因子计算而来。第26页/共49页流量的选择计算的流量用于制备柱时，可使流动相用在分析柱上有相同的线速度。但是合适的流量还取决于色谱柱的内径大小。色谱系统还受柱长增加及填料更细引起反压增加的制约。第27页/共49页梯度分离时间(GD)得到的梯度分离时间可以输入制备泵，使制备分离在此时间内流经制备柱，柱的柱体积数与相应时间流经分析型柱的体积数相同。第28页/共49页上样方法：用注射器进样;静止进样（泵停）;六通阀进样;主动阀进样;辅助泵进样;固体上样。第29页/共49页上样方法固体上样是解决样品低溶解度的一种方法，可将样品的干粉与柱填料混和，加入分离柱前的前置柱中。对于难溶的样品（5mg/ml以下，每份样品需混入5～10份填料）Miller等（1989）曾报道用前置柱方法分离0.1～1g的样品。第30页/共49页七、高效液相色谱制备色谱仪器1、高压泵（略）2、检测器绝大多数商品检测器都用于分析型工作，它们存在易饱和的问题（负载量受到限制）并不适合制备型分离。一些专门为制备型分离而设计的带有样品槽的检测器也有出售，如GowMAS公司出产的80－800LC-UV检测器，其中洗脱液以薄膜形式流经石英槽（Leutert1984），使用此检测器流速可达500ml/min。第31页/共49页高效液相色谱制备色谱仪器带有0.05mm长度的样品槽的紫外检测器可承受高达200ml/min的洗脱液流速。这种流速适合中压液相色谱分离。而我们研究半制备高效液相色谱流量一般在20－30ml之间，尤其是2－8ml之间最佳。目标化合物分离度高，分离纯化样品量也较高。例如商陆皂苷甲，收集了一个星期，得到400mg，除了作波谱分析外，还提供作药理实验。第32页/共49页高效液相色谱制备色谱仪器HPLC的检测器种类不多，两种最常用的技术——紫外和示差检测器在使用上有其局限性。示差检测器当然对无UV吸收物质能检测，但对温度很敏感，灵敏度低，对少量物质检测不理想而且不能采用梯度洗脱方式。对于无紫外吸收的物质一种日益受到欢迎的检测方法是蒸发光散射检测器（ELSD）,可用于挥发性成分，并可在梯度洗脱条件下检测。该检测方法需要通过加热的方法使溶剂挥发，因此需要安装一分流装置，对易分解的成分另外收集。也可用薄层色谱对高浓度的流出液各流分进行检测。另外也可用质谱对各流分进行定性和定量检测。第33页/共49页八、流动相的选择1、流动相的选择是分离目标化合物的关键。根据，只要选择最佳配比流动相，增加就可大大增加混合物分离度，其Rs>1.25以上，有如下好处：分离得目标化合物纯度高上柱样品量大收集到纯的目标化合物量多波谱鉴定一次成功第34页/共49页流动相的选择2、选择流动相分方法。例如反相C18柱，流动相如甲醇和水的比例可用0～90％梯度的方式来确定，找到最佳分离时的甲醇－水配比，然后用该比例溶剂洗脱进行样品分离、收集。3、选择洗脱溶剂纯度要高，否则会带来杂质，干扰分离纯化。另外溶剂在末端透过率一定要高，一般来说，使用HPLC溶剂可达到上述要求，如使用分析纯甲醇，在254nm后透过率还可以，>230nm时基线就会漂移。特别在梯度时更为严重。4、流动相中非挥发性添加剂（如离子对色谱、置换色谱）会在产物回收时引起麻烦。要采用挥发性缓冲液来改进分离效果，又易于将其除去。例如，Mierzwa等（1985）利用半制备型18烷基硅胶柱，以乙腈－0.01mol/L乙酸铵（PH4.0缓冲液）（40：60）为洗脱剂，分离得到大环内酯抗生素。第35页/共49页九、被分离色谱图的收集方法1、边缘切割和循环色谱分离当对两个多多个相距很近的主要成分进行分离时，若色谱系统的选择性不足以将该混合物分开，此时可采用循环色谱分离（Charton等1994，图5.6）。第36页/共49页被分离色谱图的收集方法在确定最佳分析型分离条件后进行制备型色谱分离，通过切割相应色谱图的前部和后部可获得纯的a和b成分。利用此法，对a和b成分的混合物（循环组分）重新进行分离，可进一步获得纯品。如果一次循环分离还不能将a和b完全分离，则可重新进行循环色谱分离。实际上，循环色谱分离与增加柱长度的效果类似。图5.6中，看到循环组分分离色谱带变宽是因泵内溶剂体积过大等柱外因素引起，应将其检测在最低限度。循环色谱分离中最先被洗脱的峰不应与上次分离中最后出的峰重叠。第37页/共49页被分离色谱图的收集方法循环色谱分离需具备两个基本装置：－密闭进样－交换柱循环前一种是将流经检测器的色谱柱流出液通过多向阀连于泵的入口。后一种是连接两根色谱柱，使洗脱液从第一根柱直接流入第二根柱。必要时，在收集到纯的样品前，通过阀门控制，可将由第二根色谱柱切割得到的样品再加到第一根柱上。该方法的优点在于样品只流经泵一次。第38页/共49页2、色谱柱的过载和中心切割为提高制备型分离能力，可使色谱柱超载（含量和浓度超载，非容积超载），由于分离不是在线性条件下进行，最佳的分离条件无法再从分析型数据来控制。在利用“中心切割”技术进行分离时，需避免主要色谱峰前后两端微量组分的污染（图5.7）。被分离色谱图的收集方法第39页/共49页被分离色谱图的收集方法用这种方法进行分离，可能损失少量a，但a的产量却可提高。在实际分离过程中，可逐渐加大上样量直到达到适当的超载程度，并通过中心切割得到一个不受色谱峰前后杂质的污染的产物。为了达到最大承载目的，样品应尽可能溶在比流动相溶解能力差的溶剂中。第40页/共49页被分离色谱图的收集方法FarmaKalidis和Murphy（1984）利用中心切割法，从大豆中分离异黄酮类成分染料本苷genistin和大豆苷deidzin。如图5.8所示，通过切割超载上样的色谱得到一富含a的成分，对其进行一次分离即可得到纯化合物a。第41页/共49页被分离色谱图的收集方法3、柱切换柱切换一词包括改变流动相方向的所有技术。利用这类技术可使一根色谱柱的洗脱液流入另一根色谱柱（Ramsterner1988）。该技术具有以下优点：分辨能力和选择性得到提高样品可在运转中纯化将第一根柱得到的部分纯化的流分通过后续的柱色谱分离（包括循环色谱可得到100％纯度的样品）微量样品可得到富集减少用于清洗色谱柱等所花的时间。第42页/共49页被分离色谱图的收集方法利用转换阀可将第一根柱的流分注入第二根柱。在第二根柱进行分离时，可同时用溶剂清洗第一根柱（Ramsteiner1984），用该法进行超载分离时十分有用。因中心切割所得组分可立刻被投入第二根柱，使其得到进一步纯化。Little和Stahel（1984）利用该方法从菊科植物甜叶菊叶子的水－甲醇提取物中直接分得甜味剂甜叶菊苷（Stevioside）第43页/共49页被分离色谱图的收集方法第44页/共49页被分离色谱图的收集方法关于循环高压液相色谱仪，日