层析分离技术

tmmbmVtttt)色分技tmmbmVtttt)色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。按固定的质载）型分类层析载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。色谱载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。也有人将层析称为色谱。用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。色层分离过程包含两部分：固相：载体或载体+能基团流相（洗脱液冲或有机溶剂对高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。液相色谱的基本原理和参数保时间()保留体积(V)R从进样开到后来出现样品的浓度极大值所需的时间保留时，用t表。在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用V表示。RR理论塔板数的计算公式：R)2容量因子k平常数K某物质的k分平衡时该物质在两相中绝对量之。而平常数K为衡时，物物质在固定相的量(q)物在固定相的浓度(q/质在两相的浓度比：ksKs物质在流动相的量(q物质在流动相的浓度（/)mm和Vm分为柱内固定相和流动相所占的体积。于是有kKsVq'溶质在固定相停留的时间分数sqsmq1溶质在流动相停留的时间分数qm在柱内溶质只转到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速(总是小于流动相的移动速(u)，等于流动相的移动速度与该谱带对1应的溶质在流动相停留的时间分数之积：()1'而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比：

utoRum

tR

0R

(1')当柱外死体积可忽略不计时，

'KVm

sttttttk'RRt0tR柱效率：塔板高度（）和塔板数（N）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。塔板高度（某段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP或H)。理论塔板数的计算公式为：2式L理论塔板高度为：H式中，L柱。

t

为准差。1/

塔板高度小，板高，色谱分离效率高。影柱效的因素（1理论塔板高度随填料粒度减少而减少；（2在一定范围内流速减小有利于提高柱效；（3减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于柱高减小；（4分子量较小的样品分子柱高较小。色层分的型

凝胶筛分离子交换反向色谱疏水色谱（层析）亲合色谱（层析）凝胶过层（积阻谱）Gelfiltrationchromatography,GFC，是一种纯粹按溶质分子在溶液中的体积大小进行分离的层析技术。应用主用于蛋白质等生大分子的分级分离和除盐。一般用作原料液的初分离，获取几个不同分子量物质分级，供进一步分离纯化使用。分离理含有不同分子小的样品进入色谱柱（层析柱）后，大的分不能通过孔道扩散进入填料颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出色谱柱（层析柱分可通过部分孔道、更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体）内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分离的目的。凝过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：（1亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液的值离子强度等物性无关。（2稳定性强，在较宽的离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；（3具有一定的孔径分布范围；（4机械强度高，允许较高的操作压力。常用的分离介质天然高子质经常使用的是聚糖凝胶（脂（Sepharose脂与葡聚糖接枝而成的复合凝胶（）及聚丙烯酰胺类和聚乙烯醇类合成凝胶TSKgel（一）联聚凝（Sephadex）⑴交联葡聚糖的商品名为不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的倍。例如为克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样克每克千胶吸水20克交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，，G-50，，G-150，和G-200因此“G的联程度，膨胀程度及分部范围。LH-20，是─G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。（二）脂凝：商品名很多，常见的有（典，（国）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构结的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水范内的盐溶液脂糖凝胶在℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。（三）丙酰凝：是一种人工合成凝胶是丙烯酰胺为单位，由叉丙烯胺联的经燥碎或加2/

3工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶（Bio-GelP国厂生产号很多至共10种P后的数字再乘1000相当于该凝胶的排阻限度。3四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel，具大网孔结构，可用分离分子量到，000，的物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。凝胶过的点：填料多为带有基、但不带电荷的惰性材料，亲水性好，又与待分离物质发生作用，因此分离条件温和，蛋白质回收率高，重现性好；工作范围广，分离分子量的覆盖面大可分离几百到数百万分子量；设备简单、易于操作，周期短。填料再生性好，可连续使用数百次到上千次。功能脱盐：分离大小两类不同的分子即无机盐与生物大分子；分级：将分子大小相近的物质分开，通常为大分子间的分离。缺点胶强度低耐的压力通常低于个大气压流低常的线速度小于。因此，处理速度较慢。但最大耐受压力可达个大气压，流速也提高近10倍无机填：表面改性后的胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶粒进行理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以外的其他效应。优点可耐受较高的压力，最高压力可达上百个大气压。具有较高的柱效率和分离度。缺点的用范围窄。以硅胶为基质的填料pH范在2.0-7.0如果超过了这个范围，将会使有机层的溶解速率加快，减少柱子寿命。凝胶特性参数（1排阻极限exclusionlimit):凝胶过滤介质排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内的最小子的相对分子质量。不同的凝胶过滤介质品牌具有不同的排阻极限的阻极限是30kD（2分级范围fractionation即能为凝胶阻并且相互之间可以得到分离的溶质的对分子量范围Sephadex分级范围为（3溶胀率：某些市售的干凝胶颗粒（如系列用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，即（溶胀处理平衡后重量燥重量）溶胀率干燥重量的溶胀率为500%。（4凝胶粒径：一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。软凝胶粒径较大一般为50150硬胶粒径较小一为5~50Sepharose和凝胶粒径分布为45~165，而Superdex和TSKToyopearl系可小到20~40甚至10。（5床体积volume即1g干凝胶溶胀后所占的体积。的体积为干。（6空隙体积指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即V值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的0溶质测定。一般使用相对分子质量为2000kD的溶性兰色葡聚糖。影响分离特性的因素、填料分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比是选择填料要考虑的首要问题。目前TSK系凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱，其特点是分离度高和吸附性小。、柱长体积排阻色谱分离度与柱长的平方根成正比，因此根据分的要求确定柱长，一般柱3/

长60-120厘对于蛋白质的分离比较理想，而长30厘米的柱子多用于快速分离。、洗脱液洗脱液的pH值离子强度都将影响到分离效果。以硅胶为基质的填料范在2.0-7.5,如果超出这个范围，将会使键合相的有机层溶解。当离子强度很低时系凝胶柱上的硅醇基会与待分离的蛋白发生离子反应一般通过加入0.3-0.5mol/L的来制。蛋白质和柱填料的疏水作用一般通过加入的乙醇或异丙醇来控制。、流速是影响蛋白质分离的重要因素。一般流速低分离效果好。如流速在小于0.1ml/min时蛋白质的分离度好；在0.5-1.0ml/min时，对于直的柱子，分离效率较高。、样品容量进样体积和样品浓度将明显影响到蛋白质的分离度，高浓度、小体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.01-0.5%，样品体积是柱体积的1-3%。凝胶筛分的应用、分离纯化GFC可于相对分子量从几百到百万的物质的分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒）分离与分析中频繁使用的液相层析法。、脱盐盐析沉淀中得到的高盐浓度的蛋白质溶液用凝胶法脱盐后，可用于其它层析过程。也可用于缓冲液的置换。、相对分子量的测定通过分子量与分配系数的线性关系进行测量，对球形分子较准确。、用于包含体的复性实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体般用玻璃管或有机玻璃管析的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于厘，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱体积大样稀释度大。分度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过米分族分离时用短柱，一般凝胶柱长厘米柱与直径的比较5:1─10:1凝床体积为样品溶液体积的倍分级分离时柱高与直径之比为─析滤板下的死体积应尽可能的小果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的。（二）凝胶的选择根据所需凝胶积估所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的胶积为其吸量的，例如Sephadex吸水量为，克─吸后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度小分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用号目的效果好，脱用Sephadex、G-50，用粗粒，短柱，流速快。（三）凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液膨胀。了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大加速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。（四）样品溶液的处理样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速心或通过短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的％（一般约行分族分离时样品液可为凝胶床的％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。（五）防止微生物的污染4/

交联葡聚糖和脂糖都是多糖类物质，防止微生物的长，在胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有叠氨钠NaN在胶层析中只要用0.02叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于3水，在20时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。可乐酮Cl)]在凝胶层析中使用浓度为0.01-％。在微酸性溶液中它的杀菌效332果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。⑶乙基代基杨钠在胶层析中作为抑菌剂使用浓度为微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。（）基代在凝层析中使用浓度为％在碱性溶液中抑效果最佳时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。GFC分离优：（）由于溶质不与介质发生作用，可采用恒定洗脱法洗脱，操作条件温和。回收率可100%；（2使用后，不需要进行柱子的清洗和再生，利于循环使用；（3作为脱盐手段，比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切率小，蛋白活性回收率高；（4分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。缺（1选择性低，料液处理量小；（2洗脱展开后产品被稀释，因此还需要具有浓缩作用的单元操作。◎色层离术2反相作用色谱反相色谱(revelsedchromatography，是于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。任何一种有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高。固定相短链烷基(如C，基和长链烷基如)改性的孔径在30纳以上的硅4胶烷基键合相。流动相有机剂主要是乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等。有机溶剂和水组成的洗脱体系可以得到高的蛋白回收率。流动相的洗脱强度是随着有机溶剂的强度增加而增加。其次序为：乙腈醇呋喃。实验表烷基链长对蛋质的反相保留没有显著的影响，但在白质的性回收上短链烷(C4C，基和长链烷基如C，C)反相填料是有区别的。表现在烷基链越长，固定相的疏水性818越强，因而为使蛋白质较快洗脱下来，需要增加流动相的有机成分；过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸附和生物活性的损失。应用领：蛋白质、多肽、核糖核酸、脱氧核糖核、信息核糖核酸等的分离和制备。◎疏水用析色）一、原理疏水作用层析（：是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。二、疏水性吸附剂将下表所列的种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后可用作水性吸附剂。常用的疏水性配基：苯基、短链烷C~C氨、聚乙二醇和聚醚等。38吸附特：疏水性吸附作的大小与配基的疏水性（疏水链长度和配基度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，疏水性高的配基较疏水性低的配基修饰密度低。一般配基修饰密度在10mol/ml配基修饰密度过小则疏水性吸附不足，密度过大则洗脱困难。5/

三、HIC操作上样及脱一规：在高盐浓度条下，蛋白质与固定相疏水缔合；浓度低时，水作用减弱，逐步被洗脱下来。一般用6-8的水溶液[如NH）SO]盐的浓度影响蛋白质的疏水性，从而影响42蛋白质的保留值。盐：Na，KH，，(NH)SO，NHOAc，KOAc，2424盐析作用强洗能力增强、响水吸的素蛋白质的疏水与其荷电性质相比复杂得多，不易定掌握。疏水性吸附剂的性疏性配基的结构和修饰密度)外流相的组成以及操作温度对蛋白质疏水性吸附的强弱均产生重要影响。离子强度及种类蛋白质的疏水吸附作用随离子强度提高而增大的种类亦影响蛋白质疏性附。疏水性吸附与盐析沉淀一样，在高价阴离子的存在下作用力较高。因此IC离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。破坏水化作用的物质SCN

ClO

I

等离子半径较大、电荷密低阴离子可减弱分子之相互作用。这