(8)-常用分子生物学技术的原理及应用

常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication分子杂交与印迹技术

MolecularHybridization&BlottingTechnologyDNA变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。Tm（

meltingtemperature）其大小与G+C含量成正比复性(renaturation):在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象。退火(annealing):热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性。复性条件：Tm－25℃

4℃以下几乎不复性（一）核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子核酸分子杂交(hybridization)

复性RNADNA核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置鉴定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础探针技术探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。探针标记方法:放射性：32P、35S和3H

非放射性：生物素、地高辛素、荧光素

(FITC、罗丹明)印迹技术将在凝胶中分离的生物大分子转移（印迹）或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。广泛应用于DNA、RNA、蛋白质检测。电转移印迹技术、真空吸引转移印迹。印迹技术的分类及应用（一）DNA印迹技术(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性、定量及相互作用研究。

（一）DNA印迹技术(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。从组织或细胞中提取基因组DNA→限制性内切酶消化→琼脂糖凝胶电泳将DNA按大小分离→含有DNA区带的凝胶在变性溶液中变性→DNA变性后从凝胶转移到固相支持物上→特异性探针与固着于膜上的DNA杂交→杂交结果反映待测核酸样品的有关基因信息。Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜（二）RNA印迹技术(Northernblotting)

基本过程与Southernblotting相似。用于RNA的定性定量分析。实验操作步骤

1细胞裂解物的准备；

2细胞裂解物的蛋白定量；

3细胞裂解物的SDS；

4蛋白质的转移；

6目的蛋白质的检测。蛋白质免疫印迹法三种印迹技术比较聚合酶链反应

PolymeraseChainReaction概念：PCR是体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术。

PCR类似于DNA在细胞内的复制过程，可以将微量目的基因扩增一百万倍以上。

1985年，美国PECetus公司的KaryMullis建立了PCR技术，使人们能够通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍，KaryMullis因此获1993年度诺贝尔化学奖。原理：类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR反应体系Mg2+

模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsTaqDNA聚合酶：

水生栖热菌(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶作用：①5’3’DNA聚合酶活性；

②无3’5’外切酶活性，35轮0.25%错配，与原始模板有差别；

DNA聚合酶最适温度：

72℃，选择72℃延伸半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5～6min

延伸温度（72℃）≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性。pfuDNA聚合酶作用：5′3′DNA聚合酶活性

3′→5′外切酶活性优点：耐热、精确度pfu>Taq不足：但pfu扩增效率通常比Taq酶略差文献报道：Taq+pfu会起到较好效果

引物人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，Tm值要相近，每条10-50pmol/100l

引物设计：利用软件，例如PrimerPremier6.0等

模板可选：DNA

mRNA→逆转录→cDNA

DNA包括：质粒、噬菌体、染色体DNA模板用量

Plasmid:1.0ngChromosome:300-500ng

注意：防止交叉污染dNTP4种脱氧核苷酸：dNTPs终浓度：50M注意：不稳定，保存时间长会失效不同的酶需不同Mg2+TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+

Mg2+（1）变性：94-95℃

GC比例高、长度很长，T↑（2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于Tm值：Tm↑退火T↑；Tm↓退火T↓若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3）延伸：500nt1min500nt3min一般：40－60sec温度PCR技术的工作原理变性95˚C延伸72˚C退火Tm－5˚C5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析PCR技术的主要用途几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术利用实时荧光定量PCR的原理，对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系统。该方法精确、灵敏、污染途径小。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。

它已逐渐代替了Northerblot以及semiRT-PCR技术。Real-timePCR

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(sanger法)DNA测序的基本策略设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。

酶反应电泳方向模板CCGGTAGCAACT3´5´GG5´3´引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3´5´TCAACGATGG5´3´读出模板互补序列读出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA的Sanger测序法(酶法)DNA的测序仪示意图computeranalysis凝胶中DNA移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜/棱镜组件化学裂解法(Maxam-Gillbert法)

反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应：NaCl+肼DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。DNA自动测序结果举例基因文库

GeneLibrary基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。基因组DNA文库第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。cDNA文库生物芯片技术Biol