基因工程载体B

基因工程载体B第1页/共93页噬菌体：感染细菌的病毒病毒：一类超显微的非细胞生物,

每一种病毒只含有一种核酸（DNA和RNA不会并存于同一病毒颗粒中）特点：只能在活细胞内营专性寄生;离体条件下,以无生命的化学大分子状态存在对抗生素不敏感，对干扰素敏感第2页/共93页病毒与宿主关系来分：温和性病毒

构建载体的好材料烈性病毒

通过改造，也可用于构建载体第3页/共93页病毒克隆载体应用的局限性：

温和性病毒和烈性病毒都存在严格的宿主专一性部分病毒的性质第4页/共93页一.噬菌体T2噬菌体结构示意图第5页/共93页三类典型形态的病毒：▼

廿面体对称的结构(球状)▼

螺旋对称的结构(杆状)▼

复合对称的结构(蝌蚪状)

大肠杆菌的T4噬菌体:由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成

病毒中复合对称的代表第6页/共93页噬菌体的生命周期分为:溶菌周期和溶源周期烈性噬菌体:

只具有溶菌生长周期的噬菌体温和噬菌体:

既能进入溶源生命周期又能进入溶菌周期的噬菌体溶源周期:

感染过程中无子代噬菌体颗粒,

噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体DNA,细菌继续生长增殖,

噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制第7页/共93页烈性噬菌体的繁殖途径

Phagereproductivecycle吸附Phageattachestobacterialcell.注入核酸PhageinjectsDNA.合成核酸和蛋白质PhageDNAdirectshostcelltomakemorephageDNAandproteinparts.装配Newphagesassemble.释放Celllysesandreleasesnewphages.透明的不长菌的小圆斑典型的烈性噬菌体的生命周期20-60min第8页/共93页温和噬菌体的繁殖途径溶原化途径溶菌途径第9页/共93页λ溶源性细菌特点：超感染免疫性（抗御同种噬菌体再次感染的特性）溶源性细菌可诱发进入溶菌周期(OL、OR摆脱cI阻遏蛋白后进入该周期)☺cI=阻遏基因O=操纵基因P=启动子L=左向R=右向第10页/共93页c、λ噬菌体在宿主体外与蛋白质结合包装成为含双链线状DNA的颗粒，分为四个区。λ噬菌体与λ噬菌体载体的特点：a、λ噬菌体是使用最早、研究最为详尽的大肠杆菌双链DNA噬菌体；1974年作为克隆载体使用。中等大小的温和噬菌体；

常用于构建基因组文库和cDNA文库；b、λ噬菌体载体克隆效率远高于质粒载体，获得的文库大而完整，构建的文库容易筛选、扩增和保存。第11页/共93页线状λ噬菌体基因组的四个区：左侧区、中间区、右侧区（调控成分、复制基因O和P、溶菌基因S和R）和末端结构

（λ噬菌体的DNA在噬菌体中是线状DNA分子，基因组是一长约48502bp的双链DNA）第12页/共93页λ噬菌体cos位点由位于λ噬菌体线形双链DNA的两端且完全互补的粘末端（12bp）结合成的双链称为Cos位点第13页/共93页att位点attLattR噬菌体插入大肠杆菌基因组方式Champbell模型λ噬菌体DNA环化的λ噬菌体DNAIntegrase催化链的交换第14页/共93页包装限制：离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中以形成有功能的病毒载体；λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力:上限：野生型DNA总量（48kb）的5％左右低限：野生型DNA总量（48kb）的75％构建λ噬菌体的基本策略与技术路线：(1)去除λ噬菌体非必须区方法：去除非必须片断(复制、裂解等非必须)

同时，抹去一些酶切位点λ噬菌体的包装限制:大小51-36kb之间第15页/共93页溶菌途径：λ噬菌体感染Ecoli后，线形λDNA注入细胞内，若进入溶菌生长途径，则粘性末端连接成环状DNA分子，指令宿主细胞合成与包装相关的系列壳蛋白和酶，复制出新的λDNA，包装成子代噬菌体颗粒，并在R蛋白和S蛋白的作用下，宿主细胞破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞。依靠cos位点形成环状的λ噬菌体DNA第16页/共93页代表性λ噬菌体载体插入型载体(insertionvectors)：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点（只能承受10kb以内的小片段外源DNA的插入，广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆）置换型载体(replacementvectors)：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代（可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生物的染色体DNA）第17页/共93页置换型插入型插入失活效应：外源的DNA克隆进入插入型的λ载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力。免疫功能失活的（inactivatiortofimmunityfunction）和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE．coliβ-galactosidase）第18页/共93页置换型一类在λ噬菌体基础上改建的，在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体第19页/共93页插入型载体

置换型载体

第20页/共93页插入型载体的克隆能力第21页/共93页置换型（取代）载体的克隆能力第22页/共93页(2)标记基因

噬菌斑：透明（有外源DNA插入）和混浊

α-互补现象：蓝白斑、红白斑

Spi-

：外源DNA取代red、gam基因，能在P2噬菌体溶源性细菌中生长(3)建立外包装系统

转染(transfection)：裸露DNA；由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程。原核生物的转染就方法来说与转化是一样的；将表达载体等导入真核细胞的过程

转导(transduction)：包装后，噬菌体颗粒介导第23页/共93页宿主细胞中λ噬菌体的包装过程第24页/共93页头部:E蛋白占72%：头部主要组成成分

琥珀突变使λ噬菌体不能形成头部结构，导致尾部蛋白累积D蛋白占20%:λDNA进入头部前体以及头部成熟作用

琥珀突变使得λ噬菌体DNA不能进入头部，头部蛋白累积第25页/共93页λ噬菌体头部和尾部的体外装配是分开进行的第26页/共93页D基因缺失突变株(D-):

溶原菌菌株BHB2690E基因缺失突变株(E-)

溶原菌菌株BHB2688

第27页/共93页注意：λ噬菌载体+外源DNA的大小：36kb～52kb体外包装：λ噬菌载体

+尾部蛋白

+头部蛋白

用于cDNA文库构建外源目的基因的克隆λ噬菌体克隆载体的应用第28页/共93页第29页/共93页二.粘粒(cosmid)λ噬菌体克隆外源DNA能力，最大23kbp，较为有效的克隆为15kbp在研究基因组功能时，需要更大克隆能力的载体(鸡胶原蛋白基因长38kb)，设计构建了cosmid(黏粒或柯斯质粒)第30页/共93页粘粒定义:包含λ噬菌体cos位点的质粒，因此，质粒DNA在体内可以被噬菌体衣壳蛋白包裹♠包含cos两端280bp以上的序列以及包装相关序列。剩余部分为质粒，具有质粒的性质；大小约4～6kb♠进行有效包装，插入片断后，总大小要在36.4-51bp之间(允许克隆的外源DNA片段长度为

31～45kb)第31页/共93页第32页/共93页粘粒的特点:(1)具有部分λ噬菌体特点体外包装后，高效转导敏感型大肠细胞，进入后环化(2)具有质粒特点复制、抗性(3)高容量克隆能力极限可达45kbp第33页/共93页λ噬菌体包装必备条件:cos位点末端酶(teminase)第34页/共93页Cosmid克隆载体

cosmid（cossite-carringplasmid）：

人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体第35页/共93页pHC79柯斯质粒载体pHC79的形体图由pBR322质粒DNA与λ噬菌体DNA的cos位点及其控制包装作用的序列构成第36页/共93页部分柯斯质粒的基本特性第37页/共93页柯斯质粒载体的特点：1）具有λ噬菌体的特性（但因不含全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb,克隆极限可达45kb左右）4）具有与同源序列质粒进行重组的能力广泛应用于基因组DNA文库的构建第38页/共93页柯斯克隆（cosmidcloning）

理论依据：1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specificcuttingsystem),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去第39页/共93页(如EcoRI)38kb-52kb第40页/共93页M13噬菌体M13单链DNA噬菌体的生命周期M13噬菌体是一丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子（“+”链DNA）,长6407bp第41页/共93页M13噬菌体的特点感染Ecoli后，在宿主细胞内形成双链的复制型DNA（replicationformDNA,RFDNA），可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。

成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞（噬菌体的感染位点在性散毛上）。但RFDNA或ssDNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。

噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的（正好与λ噬菌体相反），因此它不存在包装限制问题。第42页/共93页M13噬菌体6.4kb单链环状正链DNA基因组作载体的优点：

1)RFDNA和SSDNA都可转染E.coli，产生噬菌斑；

2)无包装限制问题（可6倍于M13基因组）；

3)

复制以双链环形DNA为中间媒介；

4）易测出外源DNA的插入方向；

5）可产生能直接测序的单链DNA分子。第43页/共93页构建M13噬菌体克隆载体的策略和途径详见第二版P116第44页/共93页噬菌粒载体（phagemidvector)由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的载体系统，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）第45页/共93页噬菌体质粒单链噬菌体辅助噬菌体大肠杆菌寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101πVXM13M13变异株XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue几种常用的噬菌粒载体的一般特征第46页/共93页pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和pUC119噬菌粒载体的分子结构第47页/共93页噬菌粒载体的特点（1）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA，可克隆高达10kb的外源DNA；拷贝数高；（2）有ampr等基因作为选择记号；可用组织化学显色反应筛选重组子；存在多克隆位点；（3）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制；（4）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。（5）可直接对克隆的基因进行核苷酸测序第48页/共93页CaMV(花椰菜花叶病毒)载体系统：双链DNA病毒TMV(烟草花叶病毒)载体系统：单链RNA病毒其他植物病毒载体系统，如单链DNA病毒：番茄金黄花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、玉米线条病毒、小麦矮缩病毒，以及RNA病毒：雀麦草花叶病毒、大麦条纹花叶病毒、番茄丛矮病毒等等。植物病毒载体第49页/共93页花椰菜花叶病毒(caulimovirus，CaMV)：实际上是一个病毒群，已知有12个种。该病毒是为数不多的植物双链DNA病毒之一。每个种的寄主范围都很窄，不感染豆类和单子叶植株，它的寄主主要是十字花科植物（集中在芸苔属）和少数非十字花科（如茄科）植物。CaMVDNA的特征：

在病毒颗粒中，CaMVDNA分子以开环形式存在，两条链的一定位置出现核苷酸序列不连续的缺口（负链：1个，即G1；正链：2个，即G2和G3）。CaMV(花椰菜花叶病毒)载体系统第50页/共93页构建CaMV载体的基本策略自然条件下，

CaMV感染宿主后，其DNA可以侵入植物细胞，但不插入染色体DNA，而是在细胞内复制、转录和翻译，但其结果是导致植物的病害。根据此特征，构建载体的基本策略是：合理利用CaMVDNA能侵入植物细胞的特性，可以将外源基因导入植物体内，但需要消除CaMV对植物的致病性。详见第二版P130第51页/共93页◆质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足动物DNA重组的需要。能感染动物的病毒可改造为动物细胞的载体病毒载体多为穿梭载体：动物细胞的培养和操作较复杂、花费较多动物病毒载体◆常用病毒载体:改造来自猴肾病毒SV40（SimianVirus40）、逆转录病毒、腺病毒和昆虫杆状病毒等目的:

将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等

第52页/共93页SV40病毒

SV40病毒呈小型20面体，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3构成。基因结构早期表达区编码大T抗原和小t抗原（即肿瘤蛋白质或抗原）。T抗原的功能是控制SV40基因组的复制和调节。小t抗原的功能不详晚期表达区合成Vp1、Vp2、Vp3（外壳蛋白），包装释放受纳细胞（permissivecell）：病毒感染宿主细胞后，使细胞裂解，并释放感染性病毒颗粒。非受纳细胞（nonpermissivecell）：不产生感染性病毒颗粒，而病毒DNA整合到细胞染色体中产生癌变。半受纳细胞（semi-permissivecell）:只有部分被感染的细胞会裂解产生出感染性的病毒颗粒。第53页/共93页第54页/共93页(1)取代型基因载体

取代型基因载体

特点：外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因组上。插入的外源DNA片段在大小同被取代的病毒基因组区段是等同的，这样形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。

但为了补充被取代的病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。第55页/共93页含有完整早期区段和复制起点的病毒-质粒载体第56页/共93页①晚期区段取代载体

SV40晚期基因被外源DNA取代后，失去合成外壳蛋白功能，若加入一种温度敏感（ts）的辅助病毒tsA58（它是一种在41℃下便不能合成T抗原的突变体），与缺乏了整个晚期区段功能的SV40病毒，可以互补，这两种病毒混合感染时，仍然能够增殖。重组体病毒能提供此种T抗原，tsA58则可以复制，并合成出外壳蛋白质，这样就能在受纳细胞中扩增表达。第57页/共93页第58页/共93页②早期区段取代载体

这种载体被外源基因取代早期基因而缺失大T抗原，可由COS细胞提供大T抗原，故可利于重组病毒在COS细胞中增殖和扩增。第59页/共93页(2)病毒-质粒重组型基因载体

一类穿梭载体例如：由大T抗原、复制子和pBR322构成pAC10载体。在细菌中扩增提取基因重组质粒，转染小鼠细胞5-6天后可高拷贝扩增并高效表达基因产物。微型病毒复制子-质粒载体，可用特殊细胞来克隆和表达相当于植物的一元载体；第60页/共93页第61页/共93页其他动物病毒载体系统-自学逆转录病毒基因载体腺病毒基因载体痘苗病毒基因载体杆状病毒表达载体详见P135第62页/共93页第3节染色体定位整合载体《基因工程》龙敏南第二版P120

楼士林第一版P138第63页/共93页质粒与病毒克隆载体的不足：1、游离于染色体之外的外源DNA分子能多拷贝复制，但易丢失，导致转基因生物的不稳定性2、随机插入染色体的外源DNA片段能稳定维持，但因插入的位点不确定，可能干扰受体细胞基因组的自稳系统，导致有害突变，造成选育转基因生物不可知性，增加难度设计背景（染色体定位整合载体）第64页/共93页染色体定位整合平台系统(geneintegrationplatformsystem)整合平台：外源DNA整合位置,即受体细胞基因组上给定的DNA区域定位整合载体:除含有一般质粒必备元件外，具有一个或两个与整合平台DNA区域同源的DNA片段（长度最好＞1kb）第65页/共93页基因打靶(genetargeting)基因定点同源重组(site-specifichomologusrecombination)第66页/共93页定位整合克隆载体的几种模式:(1)内源平台双交换置换克隆载体(2)外源平台双交换置换克隆载体(3)内源平台双交换插入克隆载体(4)内源平台单交换插入克隆载体第67页/共93页

一、定位整合克隆载体的几种模式（一）内源平台双交换置换克隆载体第68页/共93页（二）外源平台双交换置换克隆载体第69页/共93页（三）内源平台双交换插入克隆载体第70页/共93页（四）内源平台单交换插入克隆载体第71页/共93页定位整合效率与受体细胞的种属和同源DNA片段的长短有关整合效率偏低，有待改进第72页/共93页第4节人工染色体克隆载体artificialchromosome《基因工程》龙敏南第二版P142

楼士林第一版P146第73页/共93页大片段克隆载体

显著特点：载体的容载能力扩大,约100～350kb

,主要有:酵母人工染色（YAC)

细菌人工染色体（BAC)

源于噬菌体P1

的染色体（PAC)

哺乳动物人工染色体（MAC）人类游离人工染色体（HAEC）第74页/共93页酵母人工染色体(

YAC)YAC载体的复制元件是其核心组成成分:大肠杆菌中复制起始位点(ori)其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（centromere,CEN）两个端粒（TEL）筛选主要是营养缺陷型第75页/共93页第76页/共93页YAC

载体的突出特点:容载能力大动物的YAC

文库平均插入长度达900～2000kb植物YAC文库平均插入片段一般为100～350kb

构建基因组文库时,只需要较少的克隆数便可以覆盖整个基因组,使构建高等生物基因组遗传图谱和物理图谱成为可能,基因组计划得以顺利实施。

第77页/共93页缺点:

1)克隆外源基因存在嵌合现象(chimerism)2)有些YAC

克隆的稳定性差3)插入片段的分离和纯化困难，YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离4)转化效率低

第78页/共93页酵母人工染色体的应用领域在染色体区带构建YAC重叠群，可以促进大规模基因组测序和致病基因的克隆。第79页/共93页第80页/共93页细菌人工染色体(

BAC)在大肠杆菌F

因子的基础上发展而来的,其复制是严谨型的,在每个细胞中仅有1～2

个拷贝,减小了插入片段发生重组的机率人工构建的BAC较小（如pBeloBAC11仅有7.4kb，保留了与F因子的自主复制、拷贝数控制及质粒分配等功能相关基因）克隆能力可达300kb以上，远大于柯斯质粒，但小于YAC筛选通过抗性、蓝白斑等第81页/共93页BAC

载体的容载能力一般为100～350kb

(1)转化率高(2)提取质粒较方便(3)嵌合及重组现象少(4)筛选目的基因,方便快捷(5)T7

和Sp6

聚合酶启动子,可以用于转录获得RNA

探针或直接用于插入片段的末端测序第82页/共93页六倍体小麦小偃54的BAC文库情况第83页/共93页小偃54的BAC文库刚建成时有937,920个克隆，约覆盖基因组5倍。BAC文库共有三级：一级库：

488块板每个板有384个孔每个孔里有5个克隆二级库：

243块板每个板是96孔每个孔里有5×8=40个克隆三级库：保存在1,954个1.5ml的离心管中，每个离心管中有5×8×12=480个克隆；

三级库同时配备有质粒DNA，以便于筛库。目前三级库可用的大约有20个96孔板，即20×96=1920个克隆第84页/共93页P1派生人工染色体（PAC）P1噬菌体载体是在P1噬菌体的基础上构建的克隆载体，用于克隆真核基因组DNA。P1派生人工染色体（PAC)是将BAC和P1噬菌体载体二者优点结合起来的克隆体系，可以克隆100-300kb的外源DNA片段。特点1）含有卡那霉素抗性基因，便于筛选。2）其在宿主细胞中以单拷贝的形式存在，避免了因多拷贝造成的不稳定。第85页/共93页PAC载体第86页/共93页哺乳动物人工染色体（MAC）从哺乳动物细胞中分离出复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。它可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。应用领域1）有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析。2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。3）对复杂的基因做功能分析。4）用于体细胞基因治