（课件）菌种的选育及保藏

三、菌(毒、虫)种的选育培养方法按着菌(毒、虫)种的标准选育培养优良的菌(毒、虫)种是生物制品研究和生产的关键。选育培养方法一般有如下几种。（一）、自然选育培养法人们对生物制品菌(毒、虫)种的选育培养最先采用的方法就属于自然选育培养法。远在15世纪，我国民间就用良好的天花患者的干燥痂皮研成粉末吹鼻免疫。100多年前，巴斯德就选用鸡霍乱巴氏杆菌陈旧培养物制备疫苗，并获得免疫成功。此后又有学者采用加热杀死鸡霍乱巴氏杆菌首次制成了死菌疫苗。自然选育培养法是对自然界中已存在的菌(毒、虫)株进行分离，从中选择适于种用的菌(毒、虫)株。一般常以感染的动物，媒介昆虫以及污染物等获得分离。（一）、自然选育培养法分离到菌(毒、虫)株的毒力，抗原性往往都不同。某些自然分离的菌(毒、虫)株毒力很强，如自然分离的多杀性巴氏杆菌等。这些强毒株适于制造灭活菌、诊断抗原和检定用。有些自然分离菌(毒、虫)株毒力很弱，抗原性也较好，如鸡新城疫Bl株弱疫苗，L系弱毒、马立克氏病SB-l弱毒株等，这些弱毒株适于制造弱疫苗。在自然弱毒中还包括由异种动物引用过来的菌(毒、虫)株，如用火鸡疱疹病毒预防鸡马立克氏病、鸽痘病毒预防鸡痘，也有用牛病毒性腹泻-粘膜病弱毒株预防猪瘟等。这些菌(毒、虫)株是由于在自然条件下流行或传代过程中适应存在和变异的结果。（一）、自然选育培养法在测定时，还应设生理盐水或培养液阴性对照和同种菌(毒、虫)种的阴性对照，以免得出错误结论。如果阴性对照动物发病，则实验不能成立；如果阴性对照不发病，则对结论应慎重。免疫原性测定是使对菌(毒、虫)种免疫敏感的动物产生免疫力，然后再用强毒攻击，如果动物不发病死亡则表明有一定的免疫原性。如果分离的菌(毒、虫)株有数种，可分别免疫，然后交叉攻击感染以确定抗原谱。作为菌(毒、虫)种应选用的免疫原性好，且抗原谱广，能提供交叉保护的菌(毒，虫)株。（二）、人工选育培养法由于死疫苗免疫效果不理想，而且反应重，这便促使人们研究和使用弱毒活疫苗免疫。生产弱毒活疫苗所用的菌(毒、虫)种只靠自然选育培养是远不能满足要求的，因而开始了人工选育培养菌(毒、虫)种。目前，在生产中用于制造疫苗菌(毒、虫)种多为人工选育培养获得。本法是生物制品菌(毒、虫)种选育培养的最重要、最常用的方法。（二）、人工选育培养法人工选育培养法就是分离的菌(毒、虫)株在培养和传代过程中采用某些理化和生物学方法诱发其发生变异，使毒力减弱或消失而仍保持一定的免疫原性。有的毒力致弱后毒力稳定，用于制苗的代数不受限制；也有的在继代时免疫性亦随之丧失，制苗使用代数较窄。入选的微生物要经过毒力和免疫原性稳定性测定，在培养基中连续传代后不改变的，说明稳定性良好且有使用价值。人工选育培养菌(毒、虫)种可具体分以下几种方法。（二）、人工选育培养法1、物理学方法主要包括以下几个方面。（1）温度各种微生物都有其最适宜的生长繁殖温度，如果改变温度可引起发生变异，以适应环境。再通过选择生产性能比较稳定的变异株，如巴斯德将炭疽杆菌培养于42℃育成减毒株，用于预防注射；猪肺疫内蒙古系弱毒株也是经高温培养选育的。（二）、人工选育培养法（2）射线将微生物暴露于紫外线或χ射线、γ射线下，大大增强了微生物的突变频率，可从中选出变异株。如制造乙型脑炎疫苗的2-8弱毒株就是采用紫外线处理和小鼠皮下传代选育的。仔猪副寒C500号菌株选育过程中就使用了钴γ

射线处理。（二）、人工选育培养法2、化学方法主要包括以下几个方面。（1）改变培养时的气体环境需氧菌培养在厌氧环境中，或厌氧菌培养在有氧环境中，也能够逐渐适应，产生变异株。如Stern在二氧化碳环境中选育出了无荚膜的炭疽杆菌变异株（2）改变培养基的组成在细菌培养基中加入或去掉其中物质可以引起变异，并使毒力下降，成为弱毒株。如马流产C355弱毒株是在培养基中加入了醋酸铊育成的；猪肺疫630弱毒株是在含海欧牌洗涤剂培养基中连续传代育成的；猪丹毒G4T10弱毒株是在含维黄素的血琼脂上培养选育的；Williams应用亚硝酸和羟胺诱变选育了腺病毒株。能够引起变异的化学物质种类很多，除上述外还包括许多碱基化合物、烷基化合物以及吖啶类。（二）、人工选育培养法（二）、人工选育培养法3、生物学方法主要包括以下几个方面。（1）通过动物机体将强毒菌(毒、虫)株通过非易感的动物机体，可以改变强毒株的毒力，使其成为弱毒株。如将猪瘟强毒通过兔体传代使其成为猪瘟兔化弱毒用于疫苗生产，已在世界享有盛誉；通过鹌鹑成功地培育了鸡痘鹌鹑化弱毒；通过豚鼠成功地培育了布氏杆菌羊五号弱毒株；通过乳兔成功地培养了猪地方性肺炎乳兔化弱毒株等。也可以通过鸡胚培育弱毒株，如鸡胚致弱的羊痘鸡胚化弱毒。（二）、人工选育培养法（2）通过细胞培养物将强毒力菌(毒、虫)株通过细胞培养物反复传代也可以使其毒力减弱或消失。如马传染性贫血驴白细胞弱毒株，山羊痘细胞弱毒株，通过猪肾细胞继代的伪狂犬病弱毒株等。通过上述方法人工选育培养的菌(毒、虫)种，其形态、生理生化特性可能也会随之改变，但最重要的是要保证遗传上稳定的弱的毒力和有良好的免疫原性。（三）、基因重组选育培养法基因重组技术选育培养菌(毒、虫)种是上世纪80年代发展起来的一项新技术，是将编码保护性抗原的目的基因导入载体中，使之得到表达，产生大量保护性抗原蛋白，并可用作疫苗。用这种方法生产的疫苗称为基因工程疫苗。目前用这种方法选育和研制成功的有大肠杆菌K88、K99重组菌株，用大肠杆菌表达口蹄疫抗原，在牛痘病中表达狂犬病病毒的表面糖蛋白等。这一技术的建立和发展，不仅能够把各种微生物的基因进行如愿重组，使没有可用疫苗或虽有疫苗而在生产上存在很大困难的疾病的免疫预防得到可能的解决，而且将有许多更安全有效的重组基因工程疫苗代替常规疫苗制品。这一技术将为疫苗研制开辟广阔的前景。（四）、菌（毒、虫）种的保藏微生物一旦被入选为种子，应立即冻干并保存。冻干后的细菌于4℃的条件下保存；冻干后的病毒在低于-20℃的条件下保存。这样可以保