课件生化14-dna的复制和修复

第十四章DNA的复制、修复和重组

本章重点介绍遗传中心法则和DNA的半保留复制的过程和机理，对DNA的修复和重组作一般介绍。

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DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。遗传信息传递的中心法则

蛋白质翻译转录反转录复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为反转录，这是中心法则的补充。

中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。目录第一节DNA代谢的概念第二节DNA的复制第三节DNA的修复第四节体内DNA的重组DNA代谢的概念

DNA的结构是遗传信息稳定储存的绝妙装置，但是，“稳定储存”一词仅仅是对在细胞中作用的静态的不完全描述。关于DNA功能的正确描述应该包括遗传信息如何从一代细胞传递给下一代细胞，因此用DNA代谢一词来来概括这个过程更为合适。这个过程包括DNA的复制以及可能影响遗传信息构成的DNA的修复和重组。通过遗传图谱可了解催化DNA代谢酶的基因在基因组中的相对位置。大肠杆菌染色体遗传图(Geneticmap)第二节DNA的复制

一、DNA复制的概念和一般规律二、DNA复制有关的酶类三、原核细胞DNA的复制过程四、DNA复制的忠实性五、真核细胞DNA的复制特点

DNA复制(replication)

DNA复制的一般规律需要摸板半保留固定的起点和方向半不连续需要RNA作为引物亲代DNA分子亲本链亲本链复制链DNA的半保留复制实验依据

1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNA原始分子第一子代第二子代Cairns为DNA半保留复制提供的证据(1963年)

Cairns将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（B

）仅有一股链是标记的，另外一股双链（A

）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。ABC复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图环状DNA的复制ABC双向和单向复制环状

DNA复制时所形成的结构起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制DNA复制的起点和方向DNA复制叉上的半不连续

滞后链5´3´3´5´3´5´前导链复制叉移动方向冈崎片段3´3´5´5´原核生物DNA复制有关的酶类

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引发体(primosome)

：启动RNA引物合成。

(3）DNA连接酶（DNAligase）（4）DNA解链酶(DNAhelicase)(5）单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：结合在解开DNA单链上，防止重新形成双螺旋。

(6）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物DNA聚合酶催化的链延长反应5´RNA引物子链3´3´5´模板链进来的脱氧核苷三磷酸生长中的DNA链摸板DNA链DNA聚合酶的特点1、需要模板，在模板的指导下按照碱基配对原则催化合成与模板互补的子代链；2、需要引物，这是一条带有3-OH的RNA片段，聚合酶只能把一个核苷酸加在引物的3-末端，因此，新合成链的延伸方向是从５端到３端。大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ结构基因亚基数每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶活性3´-5´核酸外切酶活性5´-3´核酸外切酶活性转化率（核苷酸/秒）DNA聚合酶ⅠPolA1400+++1000-12000PolB(dnaA)4100++-2400PolB(dnaE)1010-20++-15000-60000比较项目DNA聚合酶III切除引物修复修复复制功能

1999年发现聚合酶和，它们涉及DNA的错误倾向修复（erroounerepair）DNA聚合酶的3´-5´外切酶水解位点3´3´5´5´错配碱基3´-5´核酸外切酶水解位点DNA聚合酶5´-3´外切酶活力

5´-3´核酸外切酶水解位点单链缺口5´大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ异二聚体

核心酶促使核心酶二聚化5-3聚合酶活性23-5外切酶活性“钳”安置复合物稳定模板结合；核心酶二聚化增加复制连续性的DNA“钳”核心酶大肠杆菌在原点起始复制所需的蛋白连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPTCPTTPPPGAPACPPPPOHGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'AGAACCTTG3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链原核细胞DNA的半不连续复制复制过程

复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体SSB3´3´5´前导链滞后链3´5´复制的起始DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´大肠杆菌复制原点oriC中的特殊顺序排列

GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列交感顺序交感顺序TTATCCACA

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型预引复合物(preprimingcomplex)聚合酶III核心酶大肠杆菌复制体结构示意图聚合酶I聚合酶III核心酶滞后链前导链解螺旋酶引物合成酶RNA引物引发体拓扑异构酶II-夹子-聚体-夹子-复合物RNA引物单链结合蛋白（SSB）冈崎片段的合成

3´5´3´5´3´5´DNA拓扑异构酶前导链合成（DNA聚合酶III

）滞后链前一个冈崎片段的RNA引物RNA引物引物酶SSB解螺旋酶滞后链合成（DNA聚合酶III

）复制叉移动方向(a)(b)(c)大肠杆菌染色体复制的终止oriC逆时针复制叉顺时针复制叉逆时针复制叉陷阱顺时针复制叉陷阱复制叉1复制叉2完成复制DNA拓扑异构酶IV连锁染色体连环体形成Tus-ter复合物四、复制的忠实性

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制109

~1010碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下四点:DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为10-4

~10-5

）

DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’外切酶切除后校正，可提高精确度102

~103倍）

DNA复制起始时以RNA为引物DNA复制后的错配修复系统（提高精确度102

~103倍）DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸DNA聚合酶的结构与校对功能

5´-核酸外切酶3´-核酸外切酶裂缝聚合中心裂缝内部起始时以RNA作为引物的作用

这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。五、真核细胞DNA复制的特点复制原点形成一个复制子或称自体复制顺序(automonouslyreplcatingsequence,ARS)多个起点复制真核生物的DNA聚合酶

真核DNA和原核DNA复制的主要过程是相同的，二者之间的不同在于DNA复制过程的调节及与细胞周期的关系上。真核细胞DNA多个起点复制起点起点起点起点起点起点真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶

分子量亚基数细胞内分布酶活力百分比外切酶活力DNA聚合酶

110-23，000多个细胞核～80%无120，000一个细胞核和线粒体2～15%无-400，000一个细胞核10～25%5-3外切酶DNA聚合酶

DNA聚合酶

45，000一个细胞核10～15%无第三节

DNA的修复

一个细胞一般只有一套或两套基因组DNA，DNA分子本身是不可替代的。由于天然的或环境因素，DNA会受到一系列过程的损伤，细胞中存在着一套精细的DNA修复系统，以保持储存于DNA中的信息的完整性。一、DNA的突变二、DNA修复及主要类型一、DNA的突变

DNA序列永久性改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。二、主要诱变剂碱基类似物(baseanalog)

碱基修饰剂(basemodifier)嵌入染料(intercalationdye)

紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizingradiation)一、突变的类型

碱基对的置换(substitution)—引起点突变

移码突变(framesshiftmutation)—引起多点突变沉默突变(silentmutation)—即同义突变，突变虽然替换了碱基，但氨基酸顺序未变，保持野生型的功能。

回复突变(backmutation)—克服第一次突变影响

DNA突变的类型

野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C--T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-转换

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换碱基对的置换(substitution)移码突变(framesshiftmutation)

-T-C-G-C-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-T-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT二、

DNA修复的主要类型1、错配修复(mismacthrepair)2、切除修复(excisionrepair)3、直接修复(directrepair)4、重组修复(binationrepair)5、差错倾向修复（error-pronerepair)—SOS(SaveOurSouls)修复

细胞中存在着一套精细的DNA修复系统，DNA的修复之所以可能，是因为DNA由两条互补的双链组成，当一条链损伤时，损伤部分可以被切除，并在互补链的指导下准确地修复。DNA的甲基化能够作为区分模板链和新合成链的标志3'5'AGTCTCAGCH3CH35'3'CH3AGTCCH3TCAGTCAGAGTC3'5'3'5'5'3'3'5'AGTCTCAGCH35'3'3'5'AGTCTCAGCH35'3'半甲基化的DNA3'5'AGTCTCAGCH3CH35'3'3'5'AGTCTCAGCH3CH35'3'复制复制后的短时间内，摸板链是甲基化的，但新链未甲基化几分钟内，新链被甲基化，两链变得不可区分在此时间范围内进行错配检查并修复DNA紫外线损伤的光裂合酶修复1、紫外光照射形成胸腺嘧啶二聚体2、光复合酶结合于损伤部位3、酶被可见光激活4、修复后酶被释放碱基缺陷或错配结构缺陷切开核酸内切酶核酸外切酶切除DNA聚合酶DNA连接酶修复连接碱基丢失AP核酸内切酶核酸外切酶切开切除糖苷酶插入酶碱基取代DNA的碱基切除修复系统损伤碱基AP内切核酸酶DNA聚合酶IDNA连结酶新DNADNA的核苷酸切除修复系统

DNA的重组修复胸腺嘧啶二聚体复制核酸酶及重组蛋白修复复制DNA聚合酶DNA连接酶重组差错倾向修复（SOS修复））DNA严重损伤3'5'3'5'诱导SOS蛋白基因表达，进行差错倾向修复3'5'5'3'5'5'3'5'3'5'DNASOS反应的机制未诱导的细胞靶基因lexA基因被LexA

蛋白质部分阻遏recA基因被LexA

蛋白质部分阻遏（40个不同的位点被阻遏）LexA(阻遏物)

RecA(辅蛋白酶)单链DNAATP靶基因表达lexA靶基因表达但产物被分解recA大量表达RecA促使分解LexA诱导的细胞DNA损伤小结

DNA修复之所以成为可能，是因为ＤＮＡ由两条互补的双链组成，当一条链损伤时，可以在互补链的指导下精确地修复，这正是以ＤＮＡ作为遗传信息的载体又一优越之处。

第四节体内DNA的重组

DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(geneticbination)，或者基因重排(generearrangement)。重组产物称为重组体DNA(-binantDNA)。重组的意义在于：能迅速地增加群体的遗传多样性；使有利的突变与不利突变分开通过优化组合积累有意义的遗传信息；为DNA损伤或复制障碍提供修复机制；参与许多重要的生物学过程，如参与某些生物的基因表达的调解以及生物发育过程基因加工（进行程序性重组）。

体内DNA的重组的主要类型

一、同源重组（homologousbination）二、位点特异重组（site-specificbination）三、转座重组（transpositionalbination）四、免疫球蛋白基因的重组同源重组的Holliday模型带有链切口的DNA链和第二同源DNA链并排ABabABabABabABabABabABabABab链互换产生Holliday中间体分叉迁移导致交叉点移动，切割被修复Holliday中间体可以两种方式分解，产生两套不同产物。水平切割产生部分重组产物，垂直切割产生完全重组产物

同源遗传重组及其功能

同源重组是紧密地和细胞分裂相联系的，在减数分裂中以高频率发生。同源遗传重组需要两分子之间或同一分子的不同部分同源顺序之间的遗传互换，它和细胞分裂紧密地相联系。这种重组过程的功能有三种：

1、提供了群体的遗传多样性；

2、给真核细胞染色单体之间提供一种临时的物理联系，这种联系是第一次减数分裂中把染色体正确分配到两个子细胞所必须的；

3、为DNA的损伤修复提供了机会。由重组酶催化的位点特异重组反应重组酶重组酶通过磷酸酪氨酸共价连接于DNA的切开位置切割链和新结合链连接形成Holliday中间体完成类似前两步骤的过程重组位点的连接顺序被重新组合Hollidy中间体转座(transposons)发生示意图转座子转座时靶顺序被交换切割靶DNA转座子被插入切割位点复制填充缺口，转座子的侧链顺序被加倍末端重复免疫球蛋白IgG的一级结构

variableregionsvariableregionsheavychainconstantregionsLightchainLightchain抗原结合区补体结合区人免疫球蛋白的分类

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