免疫银光技术

免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述…………………… 二、免疫荧光组织化学的原理………………… （一）直接方法…………… 检查抗原方法…………………… 检查抗体方法…………………… （二）间接方法…………… 1．检查抗体(夹心法)方法…………… 2．检查抗体方法…………………… 3．检查抗原法……………………… （三）补体法……………… 1．直接检查组织内免疫复合物方法……………… 2．间接检查组织内抗原方法……… （四）双重免疫荧光组织化学标记方法………………… （五）对照实验…………… 直接方法………… 间接方法………… 补体方法………… 三、荧光抗体的制备……………… （一）荧光素……………… 异硫氰酸荧光素………………… 四甲基异硫氰酸罗达明………… 得克萨斯红(Texasred)…………… 4．其它荧光素………… （二）荧光素标记抗体的方法…………… 1．FITC标记抗体的方法…………… 2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法…………… 3．藻红蛋白标记抗体方法…………… 4．蓝色荧光素标记抗体方法………… （三）荧光抗体的质量控制……………… 1．染色特异性和敏感性的测定方法………………… 2．F/P比值的测定方法……………… 3．荧光抗体的保存…………………… 四、免疫荧光组织化学染色方法……………… （一）荧光抗体染色方法………………… 1．直接方法…………… 2．间接方法(双层法)……………… 3．间接方法(夹心法)……………… 4．补体方法…………… 5．膜抗原荧光抗体染色方法……… 6．双重染色方法……………………… 7．荧光抗体再染色方法……………… （二）荧光抗原染色方法………………… 五、荧光显微镜检查方法……………………… （一）荧光和荧光显微镜………………… （二）荧光显微镜标本制作规定………… 1．载玻片…………… 2．盖玻片…………… 3．标本………………… 4．封裱剂……………… 5．镜油………………… （三）使用荧光显微镜注意事项………… （四）荧光图像的记录方法……………… 六、非特异性染色的消除方法………………… （一）非特异性染色的重要因素………… （二）消除非特异性染色的方法………… 1．葡聚糖凝胶G-50柱层析法……… 2．DEAE纤维素柱层析法…………… 3．荧光抗体稀释法………………… 4．纯化抗原方法……………………… 5．纯化抗体方法——免疫吸取方法……………… 6．伊文氏蓝(Evansblue)衬染色方法……………… 七、现状与展望………………… 免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事(1941)建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞(或组织)化学。它与葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素与卵白素、植物血凝素(ConA等)相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescinactivatedcellsorter(FACS)的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。80年代到90年代相继又有新的荧光素出现如R-藻红朊，B-藻红朊，C-藻青蛋白，cy2,cy3,cy5,cy7均在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜中广泛应用。由于免疫荧光组织化学的特异性，快速性和在细胞水平定位的准确性，已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检查等许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。二、免疫荧光组织化学的原理免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反映的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上具有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到本来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，运用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而拟定抗原或抗体的性质和定位，以及运用定量技术测定含量（图3-2-1）。图3-2-1紫外光激发荧光物质放射荧光示意图用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法。用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。免疫荧光组织化学分直接法、间接法和补体法。（一）直接方法检查抗原方法这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织抗原的检查。此法特异性强，常用于肾穿刺，皮肤活检和病原体检查，其缺陷是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。（图3-2-2）图3-2-2直接法检查抗体方法将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反映，而将抗体在原位检测出来。（二）间接方法1．检查抗体(夹心法)方法此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反映，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。2．检查抗体方法用已知抗原细胞或组织切片，加上待检血清，假如血清具有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上，再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体反映，在荧光显微镜下可见抗原抗体反映部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检查血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。3．检查抗原法此法是直接法的重要改善，先用特异性抗体与细胞标本反映，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。同直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以合用于同一种属产生的多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。（三）补体法1．直接检查组织内免疫复合物方法用抗补体C3荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反映，而形成抗原-抗体-补体—抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。2．间接检查组织内抗原方法常将新鲜补体与第一抗体混协议时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原抗体反映，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反映，形成抗原-抗体-补体—荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可合用于各种不同种属来源的第一抗体的检查。（四）双重免疫荧光组织化学标记方法在同一组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。（五）对照实验为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时进行以下对照实验：1．直接方法（1）标本自发荧光对照：标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观测组织内假如有荧光，称为自发荧光。（2）克制实验：可分为二步方法和一步方法。1）一步克制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。2）二步克制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。（3）阳性对照：用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。结果：如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。2．间接方法（1）自发荧光对照：同直接法。（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。（3）克制实验：同直接法。（4）阳性对照：同直接法。结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。3．补体方法（1）自发荧光对照（2）荧光抗体对照（3）克制实验（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1:10稀释先作用标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。（5）克制实验：标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。（6）阳性对照。（1）~（5）结果阴性，6和待检标本阳性时，则为特异性荧光。三、荧光抗体的制备制备荧光抗体是免疫荧光组织化学的重要技术之一，制备特异性强和高效价的荧光抗体必须选用高质量的荧光素和高效价的抗体。（一）荧光素荧光是指一个分子或原子吸取了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供应，发光也瞬时停止。异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）FITC是一种呈黄色粉末状，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存数年。易溶于水和酒精。最大吸取光谱为490~495nm，最大发射光谱为520~530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为389.4。（图3-2-3）图3-2-3FITC的分子结构式在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键结合,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。2．四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TMRITC)TMRITC是一种紫红色粉末，较稳定。其最大吸取光谱为550nm，最大发射光谱620nm呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清楚，与蛋白质结合方式同FITC。它可用于双标记示踪研究(图3-2-4)。3．得克萨斯红(texasred)得克萨斯红是一种褐色粉末状，易溶于有机溶剂，性质稳定，在4℃下能保存2年以上，最大吸取光谱为590-595nm，最大发射光谱为620-630mm，共有四种结构，常用的分子量为625.15(图3-2-5)。图3-2-4TMRITC的分子结构式图3-2-5Texasred的分子结构式4．其它荧光素如4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪(SITS)7-氨基甲基香豆素AMC呈兰色荧光；藻红素R(phycoerythrin-R)；花青(Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5,Cy7)等。（二）荧光素标记抗体的方法1．FITC标记抗体的方法（1）Marsshall氏法1）材料：抗体溶液、0.5mol/LpH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶(25-50ml)、冰及冰槽(或1000ml烧杯)、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯(500ml)、pH7.2的0.01mol/LPBS葡聚糖凝胶G-25层析柱等。2）方法及环节：①抗体的准备：取适量已知抗体浓度之溶液，加入三角烧瓶中，再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后抗体浓度为20mg/ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。②荧光素的准备：根据标记的抗体总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。③结合：边搅拌边将称取的荧光素渐渐加入抗体溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上(大约在5~10min内加完)，加完后，在4℃左右继续搅拌12~18h，通常将装置安放4℃冰箱或冰库中进行。④透析：结合完毕后，将标记的抗体溶液离心(2023r/min)10min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中再置于烧杯中用0.01MpH7.2缓冲盐水透析(0~4℃)过夜。⑤过柱：取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。（图3-2-6，图3-2-7）图3-2-6SephadexG-25对FITC标记抗体液(羊抗兔)柱层析洗脱模型图3-2-7FITC与家兔IgG球蛋白在25℃和2℃时结合的动力学(Kawamura1964)（2）Chadwick氏法1）试剂和材料：抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/LpH8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶(25ml)、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋、棉线、玻棒等。2）方法及环节：①抗体准备：用0~4℃的pH8.0磷酸盐缓冲盐水将抗体蛋白溶液稀释至浓度为30~40mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。②荧光素准备：按每毫克蛋白加入荧光素0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。③将准备的抗体与荧光素溶液等量混合，充足搅匀，在0~4℃冰箱中结合18~24h。④透析和柱层析：方法同Marshall氏法。（3）改良法试剂：1）0.01mol/LpH7.2PBS配法：NaCl18g、Na2HPO41.15g、KH2PO40.2g，溶于2023ml蒸馏水中，校定pH至7.2。2）0.5mol/LpH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5mol/LNa2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/LNaHCO3(4.2%)90ml，混匀后，校定pH至9.0。3）3%重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水碳酸钠充足溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。方法及环节：取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0.15mol/LNaCI)及缓冲液(0.5mol/LNaHCO3-Na2CO3pH9.0)稀释使每ml内含抗体10mg，缓冲液为总量的10%，降温至4℃，加入异硫氰酸荧光素，(蛋白：荧光素=80mg:1mg)，在0~4℃下电磁搅拌12~14h。然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler氏试剂测验至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%，分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，-20保存可达2年以上。2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法（1）取IgG10ml(6mg/ml)在0.1mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。（2）将四甲基异硫氰酸罗达明(每毫克IgG加入5~20g)溶于二甲亚砜(1mg/ml)，取此溶液300l,一滴一滴加入抗体溶液中，同时电磁搅拌。（3）在室温中搅拌2h，避光。（4）把结合物移入直径3cm，高30cm大小的Bio-GelP-6层析柱，用0.01mol/LpH8.0的PBS平衡过柱，流速为1.5ml/min。（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4℃保存备用。3．藻红蛋白标记抗体方法（1）巯基化藻红蛋白(phycoerthrin,PE)的制备600μl的15.5mg/ml盐酸巯醇亚胺(iminothiolanehydrochloride)加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2mlPB(pH6.8)混合，装入透析袋置入50mmol/LpH6.8PB中透析，4℃过夜，再换用pH7.5PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基。（2）巯基PE-IgG制备异双功能试剂SPDP[N-Succinimdyl3-(2-pyridyldithio)propionate]30g(1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/mlIgGPB溶液(50mmol/LpH7.5)，在室温中反映2.5h。再加入巯基化PE400μl(1.7mg/ml)加到500μl反映混合液中，室温反映12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，在4℃用PB透析过夜。加入0.01%NaN3分装，4℃保存半年。（3）PE-标记蛋白A方法1）取4.08mgPE溶于0.1mol/LpH7.4PB(含0.1mol/LNaCl)1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP无水甲醇液(2.6mg/ml)，SPDP/蛋白摩尔比为10,22℃反映5min，过SephadexG-50(1×17cm)，用100mmol/LpH7.4PBS(含0.1mol/LNaCl)平衡和洗脱。2）0.5ml蛋白(2mg/ml)100mmol/LPBS(具有100mmol/LNaClpH7.4)，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白A=9：5，22℃，40min,加入25μl二硫苏糖醇(DTT)pH7.4缓冲液，22℃，25min，同上过sephadexG-25，收集蛋白A峰。3）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反映6h，混合物4℃保存备用，以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01mol/LpH7.4PB(具有0.1mol/LEDTA、1mol/L碘乙酰胺、1%BAS和0.1%NaN3)，0~4℃保存。4．蓝色荧光素标记抗体方法Kbaffan等(1986)一方面创建了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记。（1）取7-氨基-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin,AMC)260μg溶于二甲亚砜25μl中。（2）将上液加入10mlIgG-

巴比妥缓冲液(0.5mol/L,pH8.5,内含50~100mgIgG)中，室温反映2h，过SephadexG-50除去游离荧光素,最大荧光波长430nm,最大吸取波长354nm。（三）荧光抗体的质量控制1．染色特异性和敏感性的测定方法（1）特异性染色和效价测定直接染色效价以倍比稀释荧光抗体溶液如1：2，1：4，1：8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的最大稀释度，为其染色滴度(效价)或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度(即2~4个单位)，如染色效价为1：64，实际应用时可取1：32或1：16。间接染色效价可按抗核抗体荧光染色法环节，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，染色用效价和直接法相同。（2）非特异性染色测定根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色，否则应采用消除非特异性染色的方法解决荧光抗体。（3）吸取实验在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4℃中过夜，3000r/min,离心30min，收集上清液，再用于相应抗原阳性标本染色，结果应不出现明显阳性荧光。2．F/P比值的测定方法F(荧光素)和P(抗体蛋白)的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般规定F/P的克分子比值为1~2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，减少敏感性。（1）蛋白质定量测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。（2）结合荧光素定量先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC1mg，溶于10ml0.5mol/LpH9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/LpH7.2PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10μg/ml，以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光光度计在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横座标，作标准函数图。荧光素与蛋白质结合后，其吸取光谱峰值向长波方向位移约5nm，FITC和蛋白质结合后由490nm变为493-495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。F/P比值的计算：可按以下公式计算。FITCg/ml160000×103FITCg/mlF/P克分子比值=———————×——————=0.41×蛋白质mg/ml390×106蛋白质mg/ml式中160000为抗体蛋白质的分子量，390为FITC的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103，而荧光素从克换算为微克需要再乘以106。测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下：(RB200g/ml×10-3)÷580RB200荧光抗体的克分子比值=—————————————蛋白质mg/ml÷160000(IgG)A515nmOD160000TMRITC荧光抗体克分子量比值=————或=重量比(g/g)×————A280nmOD5803．荧光抗体的保存以0~4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性减少和蛋白变性。最佳加入浓度为1：5000的硫柳汞或者1：10000，叠氮纳防腐，小量分装如0.1~1ml，真空干燥后更易长期保存。四、免疫荧光组织化学染色方法（一）标本制作（二）荧光抗体染色方法直接方法（1）染色切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体，在室温或37℃染色30min，切片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。（2）洗片倾去荧光抗体，将切片浸入pH7.2PBS中洗两次，电磁振动，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。（3）50%缓冲(0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0~9.5)甘油封固、镜检。直接法比较简朴，适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原，特异性高而敏感性较低。2．间接方法(双层法)（1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/LpH7.2PBS洗两次，10min，用吸水纸吸去多余的液体。（2）再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等)，同上环节，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，振动，缓冲甘油封固，镜检。3．间接方法(夹心法)（1）切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。（2）滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。（3）缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。（4）滴加特异性荧光抗体在切片上37℃，30min。（5）如（3）水洗。（6）缓冲甘油封固，镜检。4．补体方法（1）材料和试剂1）免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价如为1：32则免疫血清应用1：8稀释。2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反映试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4的0.1mol/LPBS中溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。（2）方法环节1）涂片或冰冻切片用冷丙酮10min固定和PBS洗一次，3min，吹至组织表面无水份。2）吸取经适当稀释的免疫血清及补体的等量混合液(此时免疫血清及补体又都各稀释一倍)滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。3）用缓冲盐水洗2次，搅拌或振动，每次5min，吸干标本周边水份。4）滴加通过适当稀释的抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同(3)。5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。5．膜抗原荧光抗体染色方法本法应用直接法或间接法的原理和环节，可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的研究，阳性荧光重要在细胞膜上。FACS即采用此原理和方法。6．双重染色方法在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法：（1）一步法双染色方法先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行染色。（2）二步法双染色方法先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现桔红色荧光。（三）荧光抗原染色方法某些抗原可以用荧光素标记，制成荧光抗原，标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体，特异性较好，敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接方法。由于多数抗原难以提纯或量少昂贵，一般很少采用此法。五、荧光显微镜检查方法（一）荧光显微镜荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具，分透谢和落射二种类型，落射光无需镜内操作方便，效果更好。它是由超高压光源、滤板系统(涉及激发和压制滤板)和光学系统等重要部件组成。是运用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观测标本的荧光图像。（二）荧光显微镜标本制作规定1．载玻片载玻片厚度应在0.8-1.2mm之间，太厚的玻片，一方面光吸取多，另一方面不能使激发光在标本上聚焦。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。2．盖玻片盖玻片厚度在0．17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光又可激发标本。3．标本组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部消耗在标本下部，而物镜直接观测到的上部不能充足激发。此外，细胞重叠或杂质掩盖，背景非特异染色引起的荧光影响判断。4．封裱剂封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易不久褪去。所以，常用甘油和0.5mol／L,pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。假如用抗褪色剂封裱荧光染色标本更有助于显微摄影。配方是将P—次苯基二胺二氢氯100mg加入PBS10m1中，调pH至9.0～9.5，再加入甘油90ml，混匀，在室温放置过夜，待其中小气泡完全消失即可使用。5．镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观测标本时，必须使用镜油，最佳使用特制的无荧光镜油可用甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。对于落射光荧光显微镜BX60，NikonE-1000无须镜油。（三）使用荧光显微镜注意事项1．严格按照荧光显微镜出厂说明书规定进行操作，不要随意改变程序。2．应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5~15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观测标本。3．防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。4．检查时间每次以1~2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3~5min后，荧光也明显减弱或褪色；所以最多不得超过2~3h。5．荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充足冷却后才干点燃。一天中应避免数次点燃光源。6．标本染色后立即观测，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。7．荧光亮度的判断标准：一般为四级，即“—”——无或可见薄弱自发荧光。“+”——仅能见明确可见的荧光。“++”——可见有明亮的荧光。“+++”——可见耀眼的荧光。（四）荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特性，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将两者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观测，作为一般定性观测，基本上是可靠的。随着技术科学的发展，采用细胞分光光度计，流式细胞仪，激光共聚焦显微镜和图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易减弱褪色，要及时摄影记录结果。方法与普通显微镜摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24o以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30s，荧光亮度就有减少。有的荧光强度不够，曝光速度太慢，只能用人工掌握曝光时间，将荧光图像拍摄下来。研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微数码相机摄影系统装置，如Nikon公司2023年在我国推出了NikonE-1000全自动荧光显微镜配备有CoolCCD与计算机联接将图像采集在软盘上再与彩色打印机连接直接打印照片。六、非特异性染色的消除方法（一）非特异性染色的重要因素组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的因素重要可分以下几点：1．一部分荧光素未与抗体结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去引起非特异性染色。2．抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异结合。3．除去检查的抗原以外，组织中还也许存在类属抗原(如Forssman氏抗原)，可与组织中特异性抗原以外的相应抗原结合。4．从组织中难以提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。5．抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。6．荧光素不纯，标本固定不妥等。（二）消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的因素采用适当的方法，常用的方法有以下几种：1．透析法荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。（1）将标记完毕的荧光抗体液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。（2）浸人0.01mol／LpH7.2的PBS中(悬于大于标记物体积约50—100倍的PBS内)，在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，透析液中无荧光即可(在荧光光源照射下)。2．葡聚糖凝胶G-50柱层析法除去游离荧光素可用葡聚糖凝胶G-25或G-50柱层析方法，加入荧光抗体15～18ml(按床体积的5％～10％加样)，使其缓慢渗人柱内，待即将所有入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30—40min，使游离荧光素充足进入分子筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的距离界线，随着大量洗脱液的不断加入，两者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分，收集中间部分，测F／P比值，合格者浓缩，分装。如仅用小量荧光抗体，可用1cm×20cm的层析柱，取2gSephadexG-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。3.荧光抗体稀释法先测定荧光抗体的特异性染色与非特异性染色效价，若两者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。4.纯化抗原方法用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最重要条件。现代免疫化学技术(免疫吸取法)和柱层析法等提供了很大的也许性。5．伊文蓝（Evanblue）衬染色方法用0.01%伊文蓝的0.01mol/LpH7.2PBS溶液稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文蓝一般配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以稀释荧光抗体。此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。七、现状与展望免疫荧光组织化学技术通过半个多世纪的不断改善和创新，已成为现代研究生物和医学的重要手段之一。由于免疫荧光技术与形态、机能相结合不断完善和发展，特别是合成了多种新荧光素与抗体容易结合，结合物稳定。可以和FITC结合进行免疫荧光组织化学双标记或三标记。至今，它已和亲合化学技术如SPA，Biotin及avidin,ConA相结合，应用领域也日益扩大，又与现代的电子计算机和扫描电视技术，共聚焦显微镜，荧光激活细胞分类器（FACS）以及数码相机摄影技术的应用，使得快速性、简便性有了更大的提高，使得定量更加准确。90年代又开展了荧光原位末端标记和荧光原位杂交技术，使得范围更广大。虽然免疫组织化学有了很大的发展，如免疫金银法，免疫胶体铁法，SP，Evision和CSA法，但由于它有自己独特的优点，特异性强，定位准确、简便、快速、鲜明，在许多领域中仍占有不可取代的地位。如肾活检、皮肤活检中IgG,IgM,IgA,C3等检测，自身抗体的检查，传染病的快速诊断，单克隆抗体的筛选及鉴定等。随着科学技术的不断发展，免疫荧光组织化学技术广泛应用于生命科学的各个领域，放射出更加灿烂五彩缤纷的荧光。参考文献Akivoshi.Kawamura,JR.Fluorescentantibodytechniquesandtheirapplication.UniversityofTokyoPress.1969王伯沄免疫荧光组织化学和荧光组织化学技术。第四军医大学科技资料增刊，1974;2:5~30HuangSN,etal.Applicationofimmunofluorescentstainingonparaffinsectionimprovedbytrypsindigestion.LabInvest,1976;35:383WickG,TraillKN,SchouestenK.ImmunofluorescenceTechnology,SelectedTheoreticalandClinicalAspects.ElseriesBiomedicalpress.Amsterdom,1982:P27~36,P181,P229~262,P317~323AkiyoshiKawamuraJr.Fluorescentantibody.TechniqueandTheirApplications.SecondEditionUniversityofTokyoPress,Tokyo,1977.P79,P141~281蔡文琴，王伯沄主编.实用免疫细胞化学.成都：四川科技出版社1990，P968~977李成文.现代免疫化学技术.上海：上海科技出版社1992；P97~100Mahmudi-A3er-s;Lacy-P;Bablit2-B;Mogbel-RInhibitionofnonspecificbindingoffluorescent-labelledantibodiestohumaneosinophils.J.Immunol-Methods.1998;227(1-2):113-9Magro-C-M;Cronison-ANTheimmunofluorescentprofileofdermatomyositis:acomparativestudywithlupuserythermatosus.J-Cutan-Pathol.1997;24(9):543-52Bausch-SB.Amethodfortriplefluorescencelabelingwithviciavillosaagglutinin,ananti-parvalubuminantibodyandananti-G-Protein-coupledreceptorantibody.Brain-Res-Brain-Prtoc.1998;2(4):286-98GregoniWeber,1916-1917.Afluorescentlifetime.Jameson-DM,Biophys-J,1998;75(1):419-22Savige-JA,Paspalians-B,Silvestrini-R,etal.Areviewofimmunofluorescentpatternsassociatedwithantineutrophilcytoplasmicantibodies(ANCA)andtheirdifferentiationfromotherantibodies.J-Clin-Pathol1998;51(18)568-751BallouB,FisherGW,DengJS,etal.Cyaninefluorochenome-labededantibodiesinvivo:assessmentoftumorimagingusingCy3,Cy5,Cy5.5andCy7.Cancer-Detect-Prev1998;22(3)251-7GruberHJ,HahnCD,KadaG,etal.AanomalousfloworescenceenhancementofCy3andCy3.5versusanomalousfluorescemcelossofCy5andCy7uponcovalentlinkingtoIgGandnoncovalentbindingtoavidin.BioconjugChem2023;11(5):696-704SouthweelBR,FumessJB.ImmunohistochemicaldemonstrationoftheNKCDtachykininreceptoronmuscleandepitheliainguineapigintestine.2023;120(5):1140-51ArsenievL,PickerdN,GoudevaL,etal.CompasativeevaluationofcommonlyusedcloneandfluorochromeconjugatesofmonoclonalantibodiesforCD34antigendetection.JHematotherStemCellRes1999;8(5):547-59O’BrjenTE,MetheneyCD,PolanskyJR.Immunoflnorescencemethodforquantitythetrabecularmeshworkqlncocorticoidresponsee(TIGR)proteinintrabecularmeshworkandschlemm’scanalcells.CurrEyeRes1999;19(6):517HuangMC,KaboO,TajikaY,etal.Detectionofmammosomatotrophsinparaffinembeddedspecimensofvariouspituitaryadenomas.ChungHuaHsssuehTsaChih(Taipei).1999;62(12):845-51王伯沄,李玉松，黄高昇,张远强主编。病理学技术北京：人民卫生出版社出版；2023年6月P380-396第三节免疫金银组织化学技术一、免疫金银组织化学技术发展史概述 ……………… 二、溶胶的基本概念 …………………… （一）胶体金 …………………… 1．离子分散体系 ……………… 2．胶体分散体系 ……………… 3．粗分散体系 ……………… （二）胶体金的一般性状 ………… 1．胶体金的颜色 ……………… 2．胶体金的稳定性 ………… 3．溶胶的聚沉现象 ………… 三、胶体金的制备方法 ……………… （一）制备胶体金的准备 ………… 1．玻璃器皿的清洁 ………… 2．试剂的配制规定 ………… （二）制备胶体金的方法和环节 ……………… 1．白磷还原法 ……………… 2．抗坏血酸还原法(StathisandFabrikanos1958) ………… 3．柠檬酸三钠还原法(Frens1973) ………… 4．鞣酸-柠檬酸三钠还原法(Slot与Gueeze1985年)……… 5．乙醇超声波还原法(BaigentandMuller1980) ………… 6．硼氢化钠还原法(Tschoppetal1982) …… 7．放射性胶体金的制备方法(KentandAllen1981) ………… 四、胶体金的质量鉴定 ……………… （一）胶体金颗粒直径测定 …………………… （二）胶体金颗粒均匀度测定 …………………… （三）影响胶体金颗粒大小的因素 ……………… 五、胶体金标记的准备 ……………… （一）待标记蛋白质的准备 …………………… 1．透析除盐: …………………… 2．去除蛋白质中的沉淀 …………………… （二）胶体金pH值的调整 ………… （三）待标记蛋白质最适稳定性的测定 ………… 1．光电比色法: ……………… 2．目测法 …………………… （四）蛋白质的胶体金标记 …………………… （五）胶体金标记蛋白质的纯化 ……………… 1．高速与超速离心法 ………… 2．凝胶过滤法 ……………… （六）免疫金探针的鉴定 ………… 六、光镜免疫金银组织化学 ………… （一）免疫金染色 ……………… 1．免疫金法(IGS) ……………… 2．蛋白A-金(PAG)放大法 …………………… （二）免疫金银法（IGSS）………… 1．石蜡切片的IGSS染色 …………………… 2．冰冻切片的IGSS染色 …………………… 3．半薄切片的IGSS染色 …………………… （三）彩色免疫金银法(CIGSS) …………………… （四）免疫金及免疫金银技术的优点 ………… 1．制备简朴 …………………… 2．标记简朴 …………………… 3．合用范围广 ……………… 4．特异性强 …………………… 5．敏感性高 …………………… 6．无毒 ………… （五）IGSS染色技术的质量控制 ……………… 1．试剂质量 …………………… 2．染色过程 …………………… 3．背景染色的消除 ………… （六）物理显影液及缓冲液的配制 ……………… 1．缓冲液的配制 ……………… 2．银显影液的配制 ………… 3．柠檬酸缓冲液的配制 …………………… 4．氢氧化钠(NaOH)无水乙醇饱和溶液的配制 ……………… 七、现状与展望 ………… 第三节免疫金银标记技术一、免疫金技术发展史早在一个世纪以前,化学家就对胶体金进行了研究,当时只是研究它的结构和金属性质。1939年KauscheandRuska把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观测金离子呈高电子密度。然而胶体金技术作为标记物应用于免疫组织化学研究是在1971年,Faulk和Taylor一方面将兔抗沙门氏菌抗血清与抗胶体金颗粒结合,用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原。此后,他们还把胶体金与抗胶原血清,植物血凝素,卵白蛋白,人免疫球蛋白轻链、牛血清白蛋白结合应用。1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人的IgG上,实现了间接免疫金染色法。1974年Bauer等报道凝集素-金复合物的应用。1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原。1981年Danscher建立了银显影液增强光镜下金颗粒可见性的免疫金银染色法(Immunogoldsliverstaining,IGSS)。到了1986年Fritz等人在免疫金银法基础上成功地进行了彩色免疫金银染色,使得结果更加鲜艳夺目。胶体金技术逐渐地得到完善和成熟,近2023此项技术得到了迅速发展和广泛应用。应用胶体金为标记物的免疫金染色(IGS)与免疫金银染色(IGSS)方法在光镜和电镜下可以单标记和双标记或多种标记,观测细胞和组织结构,可以定性,定位以至定量研究。目前它已被应用于医学和生物学研究的众多领域。二、溶胶的基本概念（一）胶体金1．离子分散体系指分散相以小分子或离子状态分散着。这种溶液具有高度稳定性,无论放置多久,分散相颗粒都不会因重力而下沉,不会从溶液中分离出来。2．胶体分散体系是指分散相颗粒在1-100nm之间的分散体系叫做胶体分散体系。胶体溶液外观透明不浑浊,在普通显微镜下看不见它的分散相粒子,不易受重力影响与分散介质分离沉降,但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向,即具有聚结不稳定性，胶体金属于这种体系。3．粗分散体系分散相颗粒是由许多分子组成,因粒子较大,用肉眼或显微镜即可看见,不稳定,极易因重力而自动沉降,外观浑浊不透明。（二）胶体金的一般性状1．胶体金的颜色溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、分散相物质的散度和入射光线的种类,是散射光还是透射光,粒子越小,分散度越高,则散射光的波长越短。对同一种物质的水溶胶来说,粒子大小不同,颜色亦不同,胶体金颗粒在5-20nm之间,吸取波长520nm,呈葡萄酒红色,20-40nm之间吸取波长530nm,液体为深红色,60nm的金溶液重要吸取波长600nm金溶液呈兰紫色,若离心去掉较大的金颗粒,溶胶呈红色。2．胶体金的稳定性影响溶胶稳定性的重要因素有三点:①胶粒间的互相吸引力。当胶粒相距很近时,这种吸引力也许导致胶粒合并变大。②胶粒及其溶剂化层(溶剂是水就是水化层)的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥,双电层愈厚,胶粒带电量愈大,排斥力愈大,愈能阻止胶粒合并聚结,溶胶愈稳定。③胶体界面的溶剂膜。当二固体间夹有一厚层液体时,这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近,只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有也许,因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的因素之一。3．溶胶的聚沉现象（1）少量电介质对溶胶的聚沉作用少量电介质即可使溶胶聚沉,但各种电介质的聚沉能力可用聚沉值来表达,聚沉值是在一定期间内使一升某浓度的溶胶产生聚沉所需电介质的最小毫克分子数。显然,聚沉值愈小,聚沉能力愈大,聚沉值从实验中得出如下的价规则:①电介质负离子对带正电的溶胶起重要聚沉作用,正离子对带负电的溶胶起重要聚沉作用。②同价离子聚沉能力几乎相等,不同价离子的聚沉能力随离子价增长而显著增长。电解质为什么能使溶胶聚沉呢？这是由于电解质与胶粒带相反电荷的离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电层厚度缩至很小和溶剂化层变得很薄时，两个胶粒间便可以更加接近即不产生斥力，两个胶质间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉。胶粒的双电层结构电图3-3-1。（2）温度对溶胶稳定性的影响一般影响不大,当温度升高时,吸附能力减弱,溶剂化限度减少,溶剂化层变薄,胶粒聚结,不稳定性增长。（3）浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时,粒子间距离缩小,引力增长,容易聚结而发生聚沉,所以制备比较稳定的溶胶,要有一定的合适浓度。图3-1-1胶粒的双电子层结构示意图三、胶体金的制备方法胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白鳞、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸椽酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。（一）制备胶体金的准备1．玻璃器皿的清洁我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净,加入清洁液浸泡24h,自来水洗净清洁液,然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3-4次,自来水冲洗掉洗洁剂,用蒸馏水洗3-4次,再用双蒸水把每个器皿洗3-4次,烤箱干燥后备用。2．试剂的配制规定(1)所有配制试剂的容器均按以上规定酸解决洗净,配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。(2)氯化金(HAuCl4)水溶液的配制:将1g的氯化金置入棕色细口试剂瓶中溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。放在4℃冰箱内保存长达几个月至1年左右,仍保持稳定。(3)白磷或黄磷乙醚溶液的配制:白磷在空气中易燃烧,要格外心小操作。把白磷在双蒸水中切成小块,放在滤纸上吸干水份后,迅速放入已准备好的乙醚中,轻轻摇动,等完全溶解后即得到饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内,放在阴凉处保存。（二）制备胶体金的方法和环节1．白磷还原法（1）白磷还原法(ZSigmondy192023)1)取1%的HAuCl4水溶液1ml,加双蒸水99ml配成0.01%的HAuCl4水溶液。2)用0.2mol/LK2CO3调pH至7.2。3)加热煮沸,迅速加入0.5ml白磷的饱和乙醚溶液,振荡数分钟至溶液呈现橙红色时即成。胶体金的颗粒直径为3nm左右,大小较均匀。（2）白磷还原法(ZSigmondy1905及ZSigmondyThiessen1925)1)取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml,加双蒸水120ml。2)用0.2mol/LK2CO3调pH至中性。3)加入1/5饱和度的白磷乙醚溶液1ml(1份白磷4份乙醚),在室温振荡约15min,溶液呈红褐色,再加热至典型的葡萄酒红色,加热可使乙醚蒸发,胶体金液体内过量的白磷通入空气后被氧化,此方法获得胶体金颗粒的直径在5-12nm之间。（3）白磷还原法的改良法(Henegouwen1986)1)取20%饱和度白磷乙醚溶液0.5ml,加双蒸水60ml。2)用1%的HAuCl4水溶液0.75ml,加0.1mol/LK2CO30.6ml,振荡变成棕色。3)加热煮沸,至溶液变成透明红色。胶体金颗粒直径为5.6nm。使用上述方法增长还原次数使金颗粒直径不断增大,两者之间的关系见表3-3-1。表3-3-1胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系还原次数 颗粒直径(nm) 正负误差1 5.6 0.92 6.7 0.93 7.9 0.94 9.8 1.35 12.0 1.02．抗坏血酸还原法(StathisandFabrikanos1958)(1)将在4℃预冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/LK2CO31.5ml、双蒸水25ml混匀。(2)在搅拌下加入1ml0.7%抗坏血酸水溶液,立即呈现紫红色。(3)加双蒸水至100ml,加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为8-13nm。3．柠檬酸三钠还原法(Frens1973)此方法是由Frens在1973年创建的,制备程序很简朴,胶体金的颗粒大小较一致,广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾,迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液,开始有些蓝色,然后浅蓝,蓝色,再加热出现红色,煮沸7-10min出现透明的橙红色。各种颗粒胶体金制备详见表3-3-2。表3-3-2柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系0.01%HAuCl4 柠檬酸三钠(ml)直径(nm)100 5.0 10.0100 4.0 15.0100 1.5 25.0100 1.0 50.0100 0.75 60.0100 0.60 70.0100 0.42 98.0100 0.32 147.0100 0.25 160.04．鞣酸柠檬酸三钠还原法(Slot与Gueeze1985年)该法是以1982年Muhplfordt法为基础,1985年Slot与Geuze对该法进行了改良,特点是通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金,并且颗粒的直径均匀一致,很适合于双标及多标研究。制备3nm、5nm、10nm、15nm的胶体金颗粒见表3-3-3表3-3-3鞣酸柠檬酸三钠还原法A液B液直径(nm)1%柠檬酸内0.1mol/LK2CO31%鞣酸H2O1%HAuCl4H2O(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)(ml)3.3 4 0.2 4 11.8 1 795 4 0.2 0.715.117910 4 0.0250.115.87517915 40.00250.0115.987179操作环节:(1)根据所需要的胶体金颗粒的大小分别配制A液和B液。(2)将配制好的A、B两液在水浴锅内加热到60℃,并通过控温装置使温度保持稳定。(3)在电磁搅拌A液迅速加入B液,继续加热直至胶体金变成葡萄酒色,时间大约7-10min。在A、B两液混合后可见溶液立即变成蓝色,大约1-3min就变成红色。5．乙醇超声波还原法(BaigentandMuller1980)(1)1%HAuCl4水溶液0.2ml加入100ml双蒸水。(2)用0.2mol/LK2CO3调pH至中性,再加入1ml乙醇。(3)用20KC、135W超声波探头浸入溶液内进行超声振荡,由此法制得的胶体金颗粒为6-10nm。6．硼氢化钠还原法(Tschoppetal1982)(1)将预冷在4℃的40ml双蒸水中加入0.6ml1%的HAuCl4。(2)再加入0.2mol/LK2CO30.2ml。(3)在搅拌下,迅速加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液(0.5mg/ml)0.4ml,一般反复加入3-5次,直至溶液的兰紫色变为橙红色为至。然后再搅拌5min,获得的胶体金颗粒直径在2-5nm之间。7．放射性胶体金的制备方法(KentandAllen1981)(1)取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加热至沸腾。(2)加入40μl195Au。(3)迅速加入4ml1%柠檬酸三钠水溶液,5-7min出现透明的橙红色。(4)其含量为1×106脉冲数/min。5nm胶体金颗粒（5万倍）10nm胶体金颗粒（5万倍）15nm胶体金颗粒（5万倍）四、胶体金的质量鉴定胶体金制备完毕后须经电镜下质量鉴定才干使用。（一）胶体金颗粒直径测定用预先解决好的覆有Formvar膜的镍网浸入胶体金溶液内,取出放在空气中干燥或37℃内烤干。然后在透射电镜下观测,重要观测金颗粒的大小,符合不符合所需要的颗粒直径,金颗粒是否均匀一致,有无椭圆形及多角形金颗粒存在。抱负的金颗粒是大小基本相等的圆形,均匀一致,无椭圆形及多角形的金颗粒存在,还可以拍片放大后测量金颗粒直径的大小。（二）胶体金颗粒均匀度测定一般需测量100个以上的胶体金颗粒,然后用记录学解决,计算胶体金颗粒的平均直径及标准差,前者反映颗粒的大小,后者说明颗粒是否均匀一致。（三）影响胶体金颗粒大小的因素假如有较多大小不等的金颗粒及有椭圆形,多角形金颗粒存在时应重新制备。一般导致这种情况的重要因素是在加还原剂的时候不是迅速一次加入,而是多次加入。再者搅拌不均匀,速度太慢没有搅拌起来,导致了颗粒大小不等。制备量的多少，容器的大小，加热的时间等也影响胶体金颗粒大小。制备了合格的胶体金以后，放在室温或4℃保存。避免低温冻存，由于冻存可导致胶体金凝集，破坏了胶体状态。胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置3个月左右。4℃冰箱内半年左右。根据胶体金的性质，有不稳定和聚沉的也许性，因此，制备完毕后最佳在20天内进行标记。五、胶体金标记的准备胶体金标记蛋白的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱的蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒互相间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处在一种薄弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白分子牢固地结合金颗粒的表面，形成了一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的互相接触，而使胶体金处在稳定状态。假如pH低蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，两者极易静电结合形成大的聚合物。假如pH高于蛋白质等电点，蛋白质带负电荷，与胶体金颗粒的负电荷互相排斥而不能互相结合。（一）待标记蛋白质的准备1．透析除盐:蛋白质溶液内应除去多余的电解质,不然过高的盐类物质会减少胶体金颗粒的Zeta电位,影响蛋白质的吸附,因此,标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水(0.005mol/LNaCl,pH7.0)透析。2．去除蛋白质中的沉淀:长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保存的抗体,特别是在浓度高于2mg/ml的情况下,很容易形成聚合物,聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响,因此,标记之前须离心以除去这些聚合物。一般以1000r/min4℃离心15min取上清液,调整蛋白质浓度至1mg/ml即可用于标记。（二）胶体金pH值的调整胶体金与蛋白质的结合成功与否,取决于pH值,一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下两者才干牢固地结合,因此,标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。需要提高胶体金的pH值时可用0.1mol/LK2CO3,需要减少胶体金的pH值时可用0.1NHCl。测定金溶液的pH也许损害pH测定计的探头,因此,一般用精密的pH试纸测定其pH即可。常用标记蛋白质的胶体金pH值见表3-3-4。（三）待标记蛋白质最适稳定的测定1．光电比色法:制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液(1ml),分别加入5ml胶体金中,迅速混匀,然后,各加入1ml10%NaCl溶液,摇匀,静置5min后测各管的OD值。根据胶体金颗粒的大小,OD在520-580nm之间测定,以OD值为纵座标,蛋白质用量为横座标作一曲线,取曲线最先与