植物基因的克隆原理与技术

关于植物基因的克隆原理与技术第一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一内容一．基因克隆所需要的酶和载体二．植物转化载体的构建三．基因克隆的方法第二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因克隆所需要的酶和载体第三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一一般认为基因工程诞生于1973年上世纪40年代——70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。第四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一1--DNA是遗传物质被证实1944年，AveryO.T.肺炎双球菌转化实验第五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一2--DNA双螺旋模型的提出Watson和Crick

1953年，JamesWatson和FrancisCrick提出了DNA的双螺旋模型。第六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一3–“中心法则”的提出以Nireberg等为代表的一批科学家确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。第七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一1–工具酶的发现和应用Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，Boyer等相继发现了ＥcoRI

一类重要的限制性内切酶。

WernerArber1968年发现限制酶第八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一1–工具酶的发现和应用

1967年，世界上五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。第九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一2–反转录酶的发现和应用1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使单个真核基因的制备成为了可能。第十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一3–载体的发现和应用

1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组。第十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一3–载体的发现和应用

1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。这一年被定为基因工程诞生的元年。第十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一提取目的DNA酶切DNA片段导入到细菌中重组菌的筛选序列分析和基因表达等研究植物基因工程的基本流程载体第十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因克隆所需要的酶类限制性内切核酸酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA修饰酶核酸外切酶单链DNA内切酶“”第十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的命名和分类3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应限制性核酸内切酶第十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一限制性内切核酸酶的发现50年代发现了大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制系统；60年代后期证明了细菌的限制和修饰系统；1968年，Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶；1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶HindII，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。第十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。第十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一限制性核酸内切酶的概念

限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300种微生物中分离出了2300种，其中商品化的限制性核酸内切酶500余种。第十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称。如：大肠杆菌Escherichiacoli

表示为Eco；属名流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae

表示为Hin；种名第十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一2、修饰性酶用M表示，限制性酶用R表示如R.HinM.Eco3、用一个正体字母表示菌株的类型如EscherichiacoliRY13EcoR4、以罗马数字表示分离出来的先后顺序如EcoRI、HindIII第二十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一限制性内切核酸酶类型：目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。I

型限制性内切酶II

类限制性内切酶III类限制性内切酶限制性核酸内切酶的分类第二十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析I型II

型III型限制-修饰活性单一多功能的酶限制酶和修饰酶分开双功能酶内切酶的蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种不同亚基活性辅助因子ATP、Mg2+、SAMATP、Mg2+、SAMMg2+甲基化位点寄主特异性的位点特异性切割否是否基因克隆中的用途用途有限十分广泛用途有限第二十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一II型限制性核酸内切酶的3大特点识别位点的特异性识别序列的对称性切割位点的规范性第二十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端(cohesiveends)：因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。5’端凸出（如EcoRI）3’端凸出（如PstI）第二十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一平末端(Bluntend)：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。第二十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一同裂酶(isoschizomers)：能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。完全同裂酶识别位点和切点完全相同如HindⅢ和HsuI不完全同裂酶识别位点相同但切点不同如XmaI

和SmaIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’第二十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一同尾酶(isocaudamers):识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。BamHIGGATCCCCTAGG5’--3’3’--5’Bgl

II5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

第二十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一

经同尾酶消化的DNA末端连接示意图5’

XXXXGGATCCXXXXXX

3’3’

XXXXCCTAGGXXXXXX

5’BamHI5’XXXXG

GATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAG

GXXXXXX5’5’

XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

AXXXXXX5’5’XXXXA

GATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

GXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII第二十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一影响酶活性的因素很多：DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素纯度的鉴定：紫外吸光值A260/A280浓度低于500ng/L酶切消化的缓冲液

Mg2+Tris-HCLBSA（牛血清蛋白）酶切反应的温度（通常为37℃）影响酶切消化的其他因素时间体积RNA限制性核酸内切酶的消化反应第二十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一酶切反应的基本步骤Buffer(10×)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

1.0kb0.4kb0.5kb0.6kb1.0kb＋－电泳紫外分析37℃1h加反应液CKMCKMTT第三十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一1、DNA连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略DNA连接酶及其应用第三十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一DNA连接酶的发现T4DNA连接酶:由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNA分子，所以在基因克隆中应用广泛。DNA连接酶:由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。

从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第三十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一DNA连接酶作用的特点A.

连接的两条链必须分别具有3′端自由羟基（-OH）和5′端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；B.

连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。第三十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一DNA连接反应的条件4℃过夜加反应液转化CK-CK+重组菌影响连接效率的因素有：温度（最主要的因素）dNTP的浓度(10M-1M)连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）反应时间（通常连接过夜）插入片段和载体片段的摩尔比第三十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一平末端DNA片段的末端加尾连接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶第三十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一平末端DNA片段加接头连接法

衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4连接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第三十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第三十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一大肠杆菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶Taq聚合酶逆转录酶DNA聚合酶及其应用第三十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高常用DNA聚合酶的特性比较第三十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一逆转录酶一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementaryDNA)。实际上，是一种RNA依赖的DNA聚合酶。来源

RNA肿瘤病毒。最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）和鼠白血病毒反转录酶（avianmyeloblastosisvirus,M-MLV）AMV的性质由和两条多肽链组成。第四十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一聚合酶活性和RNaseH活性。RNaseH：

经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以5’3’或3’5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNADNARNaseHRNADNA第四十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一逆转录酶的用途合成cDNA以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。mRNA5’AAAAAATTTTTT3’5’mRNA5’AAAAAATTTTTT3’5’第四十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一DNA修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶T4多核苷酸激酶碱性磷酸酶细菌性碱性磷酸酶Bacterialalkalinephosphatase，BAP从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。碱性磷酸酶小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。SDS中加热68℃可完全失活。第四十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一碱性磷酸酶的特性：催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。5’

P--OH3’5’

HO--P3’5’

HO--OH3’5’

HO--OH3’碱性磷酸酶第四十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一HindⅢ酶切

5’AAGCTTTTCGAA5’

碱性磷酸酶A-OH5’P-AGCTTTTCGA-P5’HO-AA-OH5’HO-AGCTTTTCGA-OH5’HO-A易载体自连碱性磷酸酶的功能防止线性化的载体份子自我连接第四十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一A-OH5’HO-AGCTTTTCGA-OH5’HO-A外源DNA5’P-AGCTTA-OH3’3’HO-ATTCGA-P5’连接酶A-AGCTTAAGCTTTTCGA-ATTCGAA转入细菌后会被修复第四十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因工程载体第四十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。第四十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一分子较小，可携带比较大的DNA片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。有适合的标记，易于选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等。载体需要满足的条件第四十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一载体分类根据功能分：克隆载体:克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中根据来源：质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体第五十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一质粒载体第五十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一质粒载体（plasimidvectors）1、质粒载体的生物学特性2、质粒载体相关知识介绍第五十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一1.质粒载体的生物学特性（1）质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒。目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。第五十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋3种。双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）第五十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一质粒DNA的分子构型质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图L:松弛线性的DNA

松弛开环的OC构型

超螺旋的SC构型

第五十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。第五十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一多克隆位点功能：用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成。特点：每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因。功能：通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选择得到转化的细胞（菌）。第五十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第五十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一

-互补

(alpha-complementation)

大肠杆菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶-片段的LacZ基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中。在一些人工构建的大肠杆菌株系中只能编码产生该酶的片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被称为是alpha-complementation。第五十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一

所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物X-Gal和诱导物IPTG的平板上分辨出来。因为这类菌落中释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别。第六十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一互补显色反应

第六十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一pBR322质粒载体

“P”表示是一种质粒；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。pBR3224363第六十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第六十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第六十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一加反应液

AmpTet+Amp连接pBR3224363第六十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一pUC质粒载体在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。第六十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第六十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一pUC质粒载体的优点:第一，具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因。所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用X-gal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第二，具有多克隆位点MCS区段。方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。第六十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。第六十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第七十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第七十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一酵母ARSARS(autonomouslyreplicatingsequence自主复制序列)---染色体自主复制序列,是从酵母中克隆的真核细胞DNA复制起点序列。酵母每条染色体由多个复制子组成,复制子平均长度为36kb。整个基因组约由400多个复制子组成。第七十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一5ˊ-XTTXATXTXTX-3ˊB1

B2B3ACS:能被复制起始位点蛋白ORC专一性识别也是ORC识别序列是转录因子ABF1的识别位点且B3可以远在1kb以外同样促进复制CA元件决定哪一段DNA序列作为复制起始位点，B元件可以增加复制起始位点的效率。

可能参与DNA双链的解旋第七十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第七十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一酵母整合质粒(YIps)酵母整合质粒(YIps)：细菌质粒含有一个酵母基因。是在pBR322的基础上插入了一个URA3基因，这个基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，可以作为选择标记。YIp不能像质粒一样复制，其复制依赖于整合到酵母的染色体上。URA3AMPr第七十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一酵母附加质粒(YEps)

YEps可以含有完整的2µm质粒，也可以只含有2µm质粒的复制起点；因为在载体中作为选择标记的基因与突变体主染色体DNA同源性很高，可以独立的复制也可以整合到酵母的染色体内。来自于2µm质粒的载体称为酵母附加载体或者YEps。第七十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一

YEp克隆载体（酵母游离型质粒）

2μm质粒的ori→EcoRⅠ酶切pBR322质粒酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切

YEp24

（图3-11）第七十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一特征（1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子（3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制 故可用酵母菌高水平表达外源目的基因第七十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一含有酵母的筛选标记ura3和DNA的自主复制序列ARS在真核细胞中独立自主的复制，拷贝数高但不稳定。酵母复制质粒（YRp）URA3AMPrARS第七十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一在复制质粒中再插入酵母着丝粒(centromer)的一个DNA片段(CEN)，帮助染色体能等量地分配到子代细胞中。所以，含有CEN序列的质粒也将以同样的机制稳定地维持在细胞中，并保证了稳定质粒在子代细胞中的等量分布。酵母稳定质粒

(YCp)URA3AMPrARSCENYCP1000bpAMPrARSURA3CEN第八十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一质粒大小大肠杆菌复制子酵母复制子大肠杆菌选择表型酵母选择表型转化频率μgDNA-1YIP5整合型5541bpPMB1无AprTetrUra+1～100YRP17复制型7002bpPMB1ARS1AprTetrTrp+Leu+103～105YEp13附加体型10.7kbPMB12μmAprTetrLeu+103～105YCp9着丝粒型10.1kbPMB1ARS1AprTetrTrp+Ura+103～104酵母菌穿梭质粒特性第八十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第八十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一λ噬菌体载体第八十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一λ噬菌体的生活周期：

第八十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一一、λ噬菌体克隆载体（一）λ噬菌体性质λDNA+外壳蛋白1、λDNA(48.5kb)噬菌体中：线性宿主细胞：环状(cos位点)第八十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第八十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb。左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb。中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。第八十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一λDNA基因结构

B2区和重组基因区是λ噬菌体进入裂解周期的非必需区（15kb，约占λ噬菌体DNA的1/3

），可将该区缺失或用外源DNA片段取代，对噬菌体的感染和生长都不会造成影响。60%区域为裂解生长所必需。cI基因：溶源过程控制基因第八十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一λ噬菌体的缺陷：⑴基因组太大（49kb）；⑵酶切点太多:有5个BamHⅠ位点，6个BgⅠ位点5个

EcoRⅠ位点。⑶野生型只能接纳一定长度的DNA。第八十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一构建λ噬菌体载体的基本原理⑴切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；⑵去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；⑶增加标记基因:λ噬菌体重组体分子不具抗生素抗性选择标记，主要是依据X-gal-IPTG显色反应来筛选重组子和噬菌斑的形态学特征。第九十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：

插入型载体（insertionvectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。

替换型载体（rePlacementvectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。第九十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第九十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一

2.组装1.连接3.侵染Why?第九十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一

由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%～105%左右的DNA，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。

插入式载体可携带的外源DNA片段较替换式为小。

第九十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一插入型载体

λgt10载体

替换了一段来自434噬菌体的片段imm434，其中基因

cⅠ

内有一个

EcoRⅠ位点。

第九十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一置换型载体EMBL3

在填充片段两端带有对称的多克隆位点

第九十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一柯斯质粒载体cosmidvectors第九十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。柯斯质粒载体cosmidvectors

“cosmid”一词是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒，又称其为粘粒载体。第九十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。粘粒载体cosmid第九十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb～6kb）载体。组成：质粒复制原点，抗性基因，多克隆位点，已连接λ的cos位点。第一百页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一①具有噬菌体的特性：cosmidvector的特点

克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌）。②具有质粒载体的特性③方便选择④高容量的克隆能力：45kb（最少不能低于30kb）。第一百零一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一凡具有cos位点的任何DNA分子只要其长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可像噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。第一百零二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一柯斯克隆理论依据是:1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)。2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specificcuttingsystem),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。第一百零三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一2023/3/23104南京农业大学生命科学学院第一百零四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第一百零五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一人工染色体载体第一百零六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一人工染色体载体人工染色体载体（artificialchromosomevecter)

:又叫大分子DNA克隆载体，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。第一百零七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一（1）自主复制序列（ARS）（autonomousreplicatingsequence）

DNA复制起始点（ori）染色体复制和遗传的三个基本组件：TELTELCENORI（2）着丝粒（centromere，cen）（3）端粒（telomeres，tel）第一百零八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一人工染色体载体酵母人工染色体载体（YAC）细菌人工染色体载体（BAC）黏粒载体（cosmid)P1人工染色体载体（PAC）第一百零九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一YAC的组成结构

3.第一百一十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一5.YAC载体的选择标记及筛选标记选择标记：营养缺陷型基因筛选标记：SUP4宿主酵母菌：trp-

和ura-

插入失活选择：SUP4酶失活的酵母菌落呈红色；不失活的菌落是白色。（赭石突变抑制基因：UAA）ade2-1第一百一十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一转化Ura-/Tra-YAC工作原理4.第一百一十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因克隆的方法

第一百一十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因的分离基因克隆：就是利用DNA重组技术及其它相关技术，获得目的（外源）基因（DNA片段）并插入适当的载体DNA分子中，并能自我“复制”，获得大量目的基因（DNA片段）的过程。第一百一十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一目的基因的制备:构建基因组文库构建cDNA基因文库利用聚合酶链式反应技术基因的化学合成第一百一十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因文库基因文库＝基因组文库＋cDNA文库

基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。

第一百一十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第一百一十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因组文库构建

用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。第一百一十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一文库能够覆盖整个基因组；插入的片段比较大；文库比较稳定，且容易保存和操作。基因组文库必须符合的基本条件第一百一十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因组文库的大小：N=ln(1-P)/ln(1-f)N：文库必需的克隆数P：文库中目的DNA片段的出现概率f：插入片段大小/全基因组大小的比值第一百二十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一期望值为0.99，插入片断为20kb的E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因组的克隆数的计算N

E.coli==1.1×103

ln(1-0.99)

ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105

ln(1-0.99)

ln[1-(2×104/3×109)]

这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。第一百二十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第一百二十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一有一些序列不能被克隆

Example:

1.序列缺乏酶切位点;2.目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的DNA片段上。Toolongforthevectorused第一百二十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一植物基因组文库构建的基本步骤：大片段DNA克隆载体的准备；大分子质量的植物基因组DNA制备；大片段DNA分子的部分酶切；载体与外源片段的连接；载体的遗传转化。第一百二十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一载体的选择

根据基因组的大小选择合适的载体构建DNA文库。

载体PlasmidphageλcosmidBACYAC

插入片断

(kb)523453501000第一百二十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一

利用质粒载体构建基因组文库该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。第一百二十六页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一利用λ噬菌体构建基因组文库第一百二十七页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一利用考斯质粒构建基因组文库第一百二十八页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一利用YAC构建基因组文库第一百二十九页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一cDNA文库

cDNA文库(completementDNALibrary)：某生物基因组转录的全部或部分mRNA经反转录产生的各种cDNA片段，分别与载体重组而存在于一种受体的群体，即cDNA基因(部分)文库。第一百三十页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一基因组文库包含该生物基因组DNA全部的序列；是具有生物种属特异性的。cDNA文库已经过剪接、去除了内含子的cDNA；具有组织细胞特异性。第一百三十一页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一cDNA文库的构建载体cDNA片段的制备分离细胞总RNA；以mRNA为模板，合成cDNA第一链；双链cDNA的合成。第一百三十二页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一mRNA纯化的方法：以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效。原理：利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱。第一百三十三页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一mRNA与oligo(dT)杂交而被吸附，其它RNA仍处于游离状态洗脱rRNA和tRNA收集洗脱下来的mRNA用纤维素柱纯化mRNA的流程示意图第一百三十四页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一第一百三十五页，共一百五十八页，编辑于2023年，星期一以已知序列为基础的克隆方法获取基因序列的途径：从文献中查取

EMBL:设在欧洲分子生物学实验室的基因库网址:http://www.ebiac.uk/ebi-home.htmlGenbank:设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库网址:/web/search/index.html

第一百三十六