基因工程制药

第三章基因工程制药第一节、基因工程制药概述第二节、基因工程制药基本技术与策略第三节、基因工程制药生产的基本步骤第四节、基因工程制药的具体实例第一节基因工程制药概述一、基因工程制药的概念二、基因工程技术所生产的药物三、基因工程制药的优点四、基因工程制药所使用的生物技术五、我国基因工程制药的进展六、基因工程制药生产的基本步骤七、基因工程制药生产的化学工艺学要求八、基因工程的发展一、基因工程制药

是指在体外通过重组DNA技术，对生物的遗传基因进行剪切、拼接、重新组合，与适宜的载体连接，构成完整的基因表达系统，然后导入宿主生物细胞内，与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖，并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物的工艺过程。二、基因工程技术所生产的药物

主要是药用活性蛋白质和多肽类，具体包括：（1）免疫蛋白质各种抗原、单克隆抗体、乙肝疫苗。（2）细胞因子各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子、促红细胞生成素。（3）激素胰岛素、生长激素、心钠素、人脑激素、人松驰激素。（4）酶类尿激酶、链激酶、葡聚糖酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、超氧化物歧化酶、α-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。三、基因工程制药的优点（1）可以生产出过去难以获得的生理活性蛋白和多肽。（2）可以通过大批量的生产方法获得足够数量的生物活性物质。（3）可以发掘出更多的内源性生理活性物质。（4）利用基因工程技术和蛋白质工程技术可以对药物蛋白进行修饰和改造，来提高药效价值，或者获得新型的化合物。（5）为制药工业提供新技术，为新药研发提供了新途径和新技术，提高药物研发的速度四、基因工程制药所使用的生物技术（1）DNA重组技术（2）淋巴细胞杂交瘤技术（3）细胞培养技术（4）克隆表达技术

基因工程制药的基本技术（1）根据DNA分子复制与稳定遗传的原理，利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达水平。（2）根据基因表达的分子生物学原理，筛选、修饰和重组启动子、增强子、操纵子、终止子等基因的转录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平基因工程制药的基本技术（3）根据分子生物学原理，选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件，强化受体细胞中蛋白质的合成过程。（4）根据生化工程学原理，从基因工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理调控其增值速度和最终数量，这也是提高外源基因表达产物产量的主要环节。五、我国基因工程制药的进展

α-1b型基因工程干扰素，是我国自行研究开发的具有国际先进水平的基因工程药物，于1997年通过III期临床，并获得国家一类新药证书。它源于中国人基因，最适于黄种人使用。六、基因工程制药生产的基本步骤1、流程图2、上游阶段3、下游阶段1、流程图获得目的基因

↓

构建重组质粒

↓

组建基因工程菌或者基因工程细胞

↓

培养工程菌

↓

产物分离纯化

↓

除菌过滤

↓

半成品检定

↓

成品检定

↓

包装2、上游阶段

主要是分离目的基因和构建工程菌细胞，其工作主要是在实验室内完成。具体内容包括：（1）获得目的基因（2）构建基因克隆载体和基因表达载体（3）将重组后的基因转移到大肠杆菌或者其它宿主细胞内3、下游阶段是指从工程菌的大规模培养，一直到产品的分离纯化，其工作主要是将实验室成果产业化、商品化。其工作重点是：（1）必须保证所表达的蛋白质具有生物活性（2）考虑基因工程蛋白质表达量的多少（3）蛋白质分离纯化的难易程度七、基因工程制药生产的化学工艺学要求（1）工程菌大规模发酵工艺最佳参数的确立（2）新型生物反应器的研制（3）高效分离介质和装置的开发（4）分离纯化技术的优化控制（5）高纯度产品的制备技术（6）生物传感器等仪器仪表的设计和制造（7）电子计算机的智能优化控制八、基因工程的发展（一）基因工程的历史（二）基因工程所生产的产品（三）基因工程的发展方向（一）基因工程的历史1973年Cohen第一例成功的克隆实验。1978年Genentech公司生产出世界上第一种基因工程蛋白药物人胰岛素。1982年第一个基因工程药物重组人胰岛素在英、美获准使用。八十年代中期PCR技术发明1985年第一批转基因家畜（兔、猪和羊）培育成功。1999年9月中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%2000年6月26日科学家公布人类基因组工作草图。2001年2月11日公布人类基因组基本信息。（二）基因工程所生产的产品胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体（三）基因工程的发展方向第一代基因工程蛋白多肽的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变改造基因第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构改造个体第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程

基因工程制药的发展经历了3个阶段1.细菌基因工程：真核目的基因难以表达2.细胞基因工程：哺乳动物细胞培养条件复杂，产量低，成本高3.转基因动、植物生产药用蛋白：生物反应器固有的优越性而成为最有发展前景的基因工程药物生产技术第二节、基因工程基本技术与策略一、酶切与连接（一）定义--限制性内切酶切及与载体连接（二）关键问题--限制性内切酶的选择及连接末端的设计。（三）具体方法：1、同种限制性内切酶产生的粘性末端连接2、同尾酶产生的粘性末端连接3、不同限制性内切酶粘性末端的连接4、人工粘性末端的连接--5’突出末端5、人工粘性末端的连接--3’突出末端6、粘性末端的添加与更换，利用人工接头Linker1、同种限制性内切酶产生的粘性末端连接2、同尾酶产生的粘性末端连接3、不同限制性内切酶粘性末端的连接4、人工粘性末端的连接--5’突出末端5、人工粘性末端的连接--3’突出末端6、粘性末端的添加与更换，利用人工接头Linker3、在利用PCR扩增基因的同时引入酶切位点利用PCR扩增基因时，在引物序列中加入特定的限制性酶切位点序列，在扩增基因的两侧就带有了该特定酶切位点。例如基因工程目标是克隆Cln3基因，并插入特定载体4、利用中间载体提供酶切位点例：Taq酶特点，常会在3’末端添加一个脱氧腺苷酸（A），因此，为克隆PCR产物，设计一个特殊的载体--T载体，其特点是3’末端含有一个脱氧胸腺苷酸（T）。PCR产物可以不经过酶切直接与T载体连接，即T/A克隆1、大肠杆菌的质粒转化（1）钙离子转化法（2）电转化法（3）大肠杆菌的噬菌体转染二、转化（1）钙离子转化法适用于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌），利用钙离子与细菌细胞膜磷脂在低温下形成液晶结构，这一状态下的细胞称为感受态细胞。此时细胞经过热脉冲发生收缩作用，细胞膜出现间隙，此时质粒DNA可通过进入细胞。（2）电转化法在瞬间强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大（3）大肠杆菌的噬菌体转染2、酵母的质粒转化方法（1）乙酸锂转化法（2）原生质体转化法（3）电转化法三、影响转化率的因素1、载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。2、载体的空间构象：

质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率要比新制备的质粒低两个数量级。3、插入片段的大小：

对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低4、受体细胞的性质：不同菌株转化效率有较大差异5、受体细胞与载体的匹配：受体细胞必须与载体相匹配，如：pBR322转化大肠杆菌JM83株转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。6、实验参数条件方面：实验操作对转化率影响较大，特别是电转化，转化电压，电容，电阻等参数的设置非常重要。四、重组克隆的检测1、抗药性检测筛选法2、显色检测3、限制酶切图谱检测4、PCR扩增检测5、原位杂交检测6、外源蛋白质功能检测1、抗药性检测筛选法3、限制酶切图谱检测限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子，是基因克隆最常用的检测方法。6、外源蛋白质检测利用插入DNA所表达的蛋白质的功能或者结构性质，检测外源蛋白质的存在。适用于表达载体的检测。第三节、基因工程制药生产的基本步骤一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、阳性克隆的筛选鉴定技术七、重组基因的序列分析八、重组基因表达过程的调控-高产工程菌株九、工程细胞的扩增和发酵生产十、基因工程菌的稳定性及其生长代谢特点十一、基因工程药物的分离和纯化技术十二、基因工程药物的质量控制一、工具酶的分离纯化（从公司购买）（一）基因工程制药所用到的工具酶

（二）关于限制性内切酶（三）关于连接酶

（一）基因工程制药所用到的工具酶限制性内切酶 甲基化酶Klenow聚合酶 T4-DNA聚合酶T4-多核苷酸激酶

碱性磷酸酶核酸酶-S1 核酸酶-Bal31绿豆核酸酶 核糖核酸酶人外切核酸酶 DNA酶Ⅰ外切RNA酶-III 外切RNA酶-VIpolyA聚合酶

T4-DNA连接酶末端脱氧核苷酸转移酶

T4-RNA转移酶逆转录酶（二）关于限制性内切酶1、宿主限制现象2、限制酶的定义3、限制酶的特征4、限制酶的作用5、基因工程所用到的限制性内切酶6、影响限制性内切酶作用的因素

1、宿主限制现象当一种病毒自宿主A分离之后，去感染宿主B的感染率只有万分之一。若将宿主B中的病毒再度分离出来，重新感染B，其感染率为100%，如再去感染宿主A，其感染率又只有万分之一。产生这种现象的原因是由于宿主细胞中存在着限制酶与修饰酶。它们对于DNA具有识别作用。（1）外源性DNA进入宿主体内后，通常被限制酶所降解，而不能表达。（2）修饰酶又称甲基化酶，通常只修饰自身体内的DNA、使其不被限制酶所降解。有时候，修饰酶会误将外源性DNA当作自身体内的DNA，而进行修饰，这就是病毒在不同宿主之间有万分之一感染率的原因。限制酶和修饰酶一起构成了限制修饰系统，它们是物种遗传稳定中进行自我防卫的组成体系。2、限制性内切酶的定义凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的酶称为限制性内切酶。分为三个类型：（1）Ⅰ型限制酶是单一的多功能酶，由于其切割产生的DNA片段5-末端不能作为多核苷酸激酶磷酸化的底物，因此不能作为基因工程的工具酶。（2）Ⅱ型限制酶只具有限制作用，是基因工程理想的工具酶。（3）Ⅲ型限制酶功能尚有待于进一步研究。4、限制性内切酶的作用（1）进行DNA重组。（2）构建新载体。（3）进行DNA分子间的杂交。（4）进行DNA序列分析。（5）制备DNA放射性探针。（6）进行DNA碱基甲基化识别。5、基因工程所用到的REEcok-I Hind-III BamH-IPst-I Sst-I Sal-IAva-I Bcl-I Hind-IIHpa-I Bgl-II

Cla-IHae-III Hha-I Hinf-IHpa-II Mbo-I Sma-IXba-I Xha-I6、影响限制酶作用的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）DNA的结构（4）反应的温度最适温度（5）反应的缓冲体系反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、BSA、它们具有激活酶、稳定酶的作用。线性DNA连接前的末端去磷酸化Alkalinephosphotase虾来源的酶(SAP)、大肠杆菌来源的酶(BAP)、小牛肠来源的酶(CIAP)（三）关于连接酶1、定义凡是能够催化DNA片段5-末端的磷酰基与3-末端的羟基结合成磷酸二酯键的酶，称为连接酶。2、作用主要用于

（1）正常DNA的合成。

（2）损伤DNA的修复。3、种类

（1）DNA-ligase-广泛存在于生物细胞之中，主要取自于大肠杆菌E.coli。

（2）T4-DNAligase来自于经过T4-噬菌体感染的大肠杆菌E.coli。二、基因工程载体的分离纯化（一）基因工程载体的必备条件（二）基因工程载体的种类

（一）基因工程载体的必备条件

（1）具有有效运载能力。

（2）载体自身能够独立复制，并且在宿主体内进行自主性复制。

（3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体内进行自主性复制。

（4）在宿主体内，能够控制外源基因的表达活动。

（5）能够携带大小不同的外源性目的基因。

（6）鉴定方便、装卸技术简单。

（7）容易控制、安全可靠。

基因工程载体的必备条件（8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选标记。（9）应具有很强的启动子。（10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。

（11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源基因区段，而不转录其它无关基因。（12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够顺利于进行翻译（二）基因工程载体的种类1、细菌质粒2、真核基因病毒DNA3、λ噬菌体DNA4、单链DNA-噬菌体M13载体5、人工质粒载体科斯质粒6、酵母人工染色体7、其他载体

1、细菌质粒（1）质粒的定义（2）质粒的特性（3）质粒的分类（4）质粒载体的具备条件（5）常用的细菌质粒

（2）质粒的特性独立于细菌染色体之外的环状DNA。其遗传特性属于非染色体控制。能够进行自我复制。容易在宿主体内进行转移和迁移。可编码宿主染色体所不具有的基因。能够赋予宿主额外的遗传特性：

A、编码产生抗生素酶的抗性基因，

B、编码产生糖酵解酶系的基因，

C、编码产生抗重金属酶的抗性基因。（3）质粒的分类F质粒可使宿主A的部分基因随着F质粒一起转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。R质粒可编码宿主A的一种或者数种抗生素抗性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的另一宿主B的体内，使得宿主B也获得同样的抗性。Col质粒能编码大肠杆菌毒素基因，通过表达之后产生的大肠杆菌毒素可以使得不带Col质粒的其它菌株死亡。（4）质粒载体的具备条件质粒载体，也称质粒克隆载体，是指用于实现基因工程操作的质粒。必须具备以下条件：（1）其分子结构中必须具有多个单一限制性内切酶的位点。（2）构建重组质粒之后必须具有转化功能。（3）分子量较小，易于操作。（4）宿主范围较为单一、无感染性。（5）常用的细菌质粒pBR322 pBH10 pBH20pTR262 pAT153 pXf3Pmk16 pKC7 πVX

[B]、ColE-I质粒[C]、pAT153质粒[D]、Ti质粒典型质粒1典型质粒2典型质粒3[B]、ColE-I质粒ColE-I为大肠杆菌E.coli类型的质粒。ColE-I分子中编码有细菌毒素基因。ColE-I分子中还编码有使宿主具有对大肠杆菌素E-I产生免疫性的基因。ColE-I质粒携带上外源性目的基因之后，不影响它对大肠杆菌素E-I产生免疫力。ColE-I质粒的基因拷贝数量很大，数小时之后，ColE-I质粒DNA占宿主DNA的50%左右，有利于开展工程化发酵生产。[C]、pAT153质粒是pBR322的改进型，分子量更小，同时也不易受物理因素的影响；其基因拷贝数量大为增加。[D]、Ti质粒诱导植物细胞肿瘤的质粒，可随机整合到植物细胞的染色体DNA之中；作为植物基因的天然工程载体，可将外源性目的基因转化至双子叶植物细胞中2、真核基因的病毒载体（1）病毒载体的优点（2）已经研究的真核基因病毒载体（1）病毒载体的优点具有很高的拷贝数量有强大的启动子可保证目的基因的高效表达

（2）已经研究的真核基因病毒DNA[A]、SV40病毒DNA[B]、牛乳头瘤病毒[C]、RNA病毒[D]、昆虫杆状病毒[E]、人痘病毒DNA[F]、猴空泡病毒DNA[G]、人腺病毒DNA[H]、人牛痘病毒DNA[I]、逆转录病毒载体[A]、SV40病毒DNA（A1）SV40病毒DNA的特性（A2）SV40病毒DNA的基因组（A3）SV40病毒DNA载体的构建（A4）SV40病毒DNA载体的使用方法（A1）SV40病毒DNA的特性为环状双螺旋结构，其宿主为动物细胞。SV40病毒有二种表达方式：

（1）游离表达方式，SV40DNA和外源性DNA，形成重组DNA，进入宿主体内，以重组DNA的方式表达。

（2）结合表达方式，重组DNA整合到宿主染色体的DNA之中，与染色体基因一起表达。（A2）SV40病毒DNA的基因组（A3）SV40病毒DNA载体的构建（A4）SV40病毒DNA载体的使用方法[G]、腺病毒腺病毒DNA载体（Ad5）[I]、逆转录病毒载体（I1）BDRetro-XTM逆转录病毒通用包装系统（I2）逆转录病毒表达的步骤（I3）腺病毒和逆转录病毒的比较（I1）BDRetro-XTM逆转录病毒通用包装系统系统包含：1、逆转录病毒DNA含有：多克隆位点、病毒包装信号Y、抗性标记Neo等区域。2、带有编码病毒表面蛋白的载体。3、包装细胞:整合了病毒衣壳蛋白，逆转录酶基因。（I2）、逆转录病毒表达的步骤1、获得目的基因

2、构建重组逆转录病毒DNA

3、重组逆转录病毒的包装、收集

4、转导细胞，进行蛋白表达

腺病毒表达系统：

•在寄主细胞中呈游离态，基因瞬时表达•侵染分裂期或非分裂期的细胞•高水平的蛋白质表达•病毒的效价高•平均可插入8kb的外源片段•会引起体内的免疫反应逆转录病毒表达系统

•插入基因组，长期、稳定的基因表达，可以遗传•只能侵染分裂期的细胞•中度的蛋白表达水平•病毒效价较高•平均可插入6.5kb的外源片段•不会引起体内免疫反应（I3）、腺病毒和逆转录病毒的比较3、λ噬菌体DNA（1）λ噬菌体DNA的特性（2）λ噬菌体DNA的改造（3）λ噬菌体DNA的体外包装（4）l噬菌体载体的构建（5）l噬菌体载体的使用（6）l噬菌体载体的优点（1）λ噬菌体DNA的特性λ噬菌体DNA为双链的DNA病毒，其宿主是大肠杆菌。已经发现λ噬菌体DNA可编码61个基因。[A]、λ噬菌体DNA在宿主体内的生活方式（1）溶源方式λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的DNA之中，伴随着大肠杆菌的DNA的复制而复制，这种方式是λ噬菌体DNA作为基因工程载体的理论依据。（2）溶菌方式λ噬菌体感染大肠杆菌之后，终止了大肠杆菌染色体DNA所控制的遗传信息表达，并进一步分解大肠杆菌DNA，最后导致大肠杆菌完全溶解。[B]、λ噬菌体DNA的结构噬菌体的基因组是双链DNA，约45kb。其粘性末端有12个核苷酸长，称为cos

序列。在病毒粒子中为线状，进入细胞后转为环状。基因组分为二部分：

（1）其中一半基因，控制着生命活动周期。

（2）另一半基因，可被外源性目的性基因所取代，而不影响噬菌体的生命活动。λ噬菌体DNA连接上外源性目的性基因之后，其外源基因的表达由噬菌体DNA控制。l噬菌体基因（2）λ噬菌体DNA的改造野生型λ噬菌体DNA分子较大，其结构基因也很复杂，并且常常容纳不下分子量更大的外源性目的基因DNA片段。因此需要对其进行改造。改造的方法有：（1）遗传学方法将λ噬菌体DNA交替地在不含质粒的大肠杆菌、和含质粒的大肠杆菌的宿主内生长，来删去其过多的限制酶位点。（2）体外删除法将λ噬菌体DNA在体外进行限制酶消化，再将未被切割部分经过蛋白质包装后，去感染大肠杆菌。经过几代连续培养之后，λ噬菌体DNA就会失去不需要的限制酶位点。（3）λ噬菌体DNA的体外包装[A]、体外包装的作用[B]、λ噬菌体DNA包装的原理[C]、λ噬菌体DNA的包装过程

A、λ噬菌体包装的作用

λ噬菌体DNA连接上外源性目的基因，就成为重组DNA分子，但是，重组之后的DNA分子必须经过包装，加上蛋白质外壳形成完整的病毒颗粒，才具有感染宿主的能力。B、λ噬菌体DNA包装的原理

λ噬菌体DNA的头部蛋白+重组DNA分子+λ噬菌体DNA尾部蛋白，在适当条件下混合，就能够自动地包装成完整的λ噬菌体病毒颗粒。[C]、λ噬菌体DNA的包装过程Dam-λ-噬菌体：在其感染宿主之后的溶菌物中产生大量的λ噬菌体DNA头部蛋白

+

charon系列载体：charon16、charon17、charon20、charon21、charon28、charon30、charon4A。它们都是目的基因的载体

+

Eam-λ-噬菌体：在其感染宿主之后的溶菌物中产生大量的λ噬菌体DNA尾部蛋白

↓

经过重组的DNA分子：基因E-基因A-基因D（其产物成份为外壳蛋白）

↓

包装成噬菌体头部+基因W产物+基因F产物

↓

使得头部与尾部完整相连

↓

形成完整的λ噬菌体病毒颗粒。（4）l噬菌体载体的构建（A）

缩短长度（B）改造酶切位点（C）增加选择标记（D）

构建琥珀型突变（A）

缩短长度插入型载体与取代型载体插入型载体取代型载体（B）改造酶切位点野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个。为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。（C）增加选择标记（D）构建琥珀型突变目的：避免有害重组体的扩散（5）l噬菌体载体的使用重组lDNA的构建(酶切，连接）噬菌体的体外包装噬菌体侵染大肠杆菌重组lDNA的分离（6）l噬菌体载体的优点容量大，装载能力可达26kb，便于构建基因文库重组子筛选较为方便DNA提取操作较为简便4、单链DNA噬菌体--M13载体噬菌体M13的宿主是大肠杆菌。噬菌体M13的遗传物质是环状单链DNA。噬菌体M13感染宿主之后，在含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的Xgal培养基中生长时，会形成蓝色噬斑。通过蓝色噬斑的出现可以显示噬菌体M13的存在。感染宿主之后，噬菌体M13所释放的单链DNA可用于制作放射性标记探针，用来检测RNA的结构。5：人工质粒载体--科斯质粒

是人工构建的特殊类型的质粒。科斯质粒是同时具有质粒特性和λ噬菌体DNA特性，是一种具有双重性质的特殊载体。

[A]、科斯质粒的基本组成[B]、科斯质粒的特性[C]、科斯质粒的用途[A]、科斯质粒的基本组成（1）含有λ噬菌体DNA的粘性末端序列（COS序列）。（2）含有质粒的一个复制起始区。（3）含有质粒的一个抗药性标记。（4）具有多种限制性内切酶的单一性切点。[B]、科斯质粒的特性（1）分子量较小，由4kb-6kb组成。（2）重组之后可以进行体外包装(cos末端）。（3）进入宿主细胞之后能够进行复制扩增。可以象质粒在大肠杆菌内复制，不裂解细胞。（4）装载量大（可达45

kb)。[C]、科斯质粒的用途构建基因文库克隆超大基因，如鼠的二氢叶酸还原酶基因，40kb以上。分析基因家族区段。6、酵母人工染色体（1）酵母人工染色体的必备元件（2）酵母人工染色体的结构（3）酵母人造染色体的使用（1）酵母人工染色体的必备元件复制起始位点着丝粒：与有丝分裂时染色体在子细胞中的分配有关。端粒：与末端复制有关，起保护作用。（2）酵母人工染色体的结构（3）酵母人造染色体的使用三、外源DNA和目的基因的分离和获得（一）基本操作方法（二）不同类别DNA的提取技术（三）目的基因的制备（四）目的基因的鉴定技术1、操作条件（1）含盐的中性缓冲液以防在除去蛋白质的时候，使核心酸产生不可逆转的变性。（2）低温条件防止DNA在振荡、机械操作过程中的降解、断裂。（3）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、EDTA）以防止DNA被酶解。2、提取方法（1）机械法破坏细胞，释放出DNA。（2）酶消化法破坏细胞，释放出DNA。（3）用酶使蛋白质变性除去蛋白质之后，就剩下DNA。（4）用酚、去垢剂使蛋白质变性除去蛋白质，剩下DNA。3、分离方法（1）DEAE—纤维素柱层析法。（2）羟基磷灰石柱层析法。4、纯化方法分子筛层析法。凝胶电泳法。乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法。（二）不同类别DNA的提取技术1、质粒DNA的提取2、细菌染色体DNA的提取3、真核生物DNA的提取4、病毒DNA的提取2、细菌染色体DNA的提取采用冻融、溶菌酶、EDTA处理、去垢剂处理使得细胞裂解。

↓

裂解液用胰RNase和蛋白酶处理，使RNA和蛋白质降解。

↓

残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿=1：1）溶液进行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机相与水相之间。

↓

含DNA的水相用乙醇沉淀，以获得丝状的DNA沉淀物，

↓

沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂。

↓

最后采用氯化铯（CsCl2）进行密度梯度离心法分离。3、真核生物DNA的提取（1）提取方法在0度的低温环境下，用去垢剂裂解真核细胞。

↓必须低温环境，否则细胞核膜崩裂，细胞质中的DNA酶进入细胞核，使DNA降解。

↓裂解液用蛋白酶将蛋白质降解，留下DNA。

↓用溴化乙锭染料进行密度梯度离心，不同DNA在梯度的不同位置形成区带。（2）注意事项对于纯度要求较高的DNA，必须采用氯化铯（CsCl2）密度梯度离心法进行分离。操作时要防止丢失线粒体DNA、和卫星DNA等密度异常成份。要防止低分子量的DNA的污染。4、病毒DNA的提取（方法一）

用少量λ噬菌体感染宿主，然后用大量的培养基进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被λ噬菌体感染。此法适应于制备大多数噬菌体。4、病毒DNA的提取（方法二）λ噬菌体可以通过溶源的方式，借助大肠杆菌的DNA而产生大量的λ噬菌体DNA。

↓

在培养体系中加入Dnase和Rnase，以分解宿主所释放的核酸。

↓

反应液离心除去沉淀，上清液用乙二醇沉淀，离心除去上清液

↓

沉淀用缓冲液分散，加入氯仿，使噬菌体的蛋白质变性而沉淀，

↓

释放出噬菌体DNA，离心除去沉淀物。

↓

上清液用氯化铯（CsCl2）密度梯度离心、或者用甘油密度梯度离心

↓

收集纯化的噬菌体DNA，经透析除去无机盐、以及溶剂

↓

用蛋白酶消化使蛋白质降解

↓

用酚进行抽提和离心，反复2—3次。

↓

上清液再用PH=8.0的TE缓冲液充分透析

↓

最终得到高纯度的λ噬菌体DNA（三）目的基因的制备1、物理分离法2、化学合成法3、从基因文库中分离分子杂交分离法4、逆转录法5、PCR技术法聚合酶链反应技术2、化学合成法（1）化学合成法的概念和分类（2）化学合成法的优缺点（3）化学合成法的实例（1）化学合成法的概念和分类化学合成法：以5-脱氧核苷酸、3-脱氧核苷酸、5-磷酰基寡核苷酸片段为原料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学合成法。用于已知基因的核苷酸序列或已知小分子蛋白质或多肽的编码基因分类：[A]、磷酸二酯法[B]、磷酸三酯法[C]、固相亚磷酸三酯法（2）化学合成法的优缺点化学合成法的优点随意性强，可通过人工设计，进行合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有力的手段。化学合成法的缺点：

（1）反应专一性不强、副反应多。

（2）合成片段越长、分离纯化就越困难、产率就越低。

（3）无法合成太长的基因。

（4）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子带来了很大困难，常常是南辕北辙。

（5）合成费用较高。3、从基因文库中分离分子杂交分离法（1）构建基因文库单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的百万分之一，数量十分微小，这就导致直接从真核生物染色体上制备目的基因的概率很小。为此，通过构建基因文库，借助宿主细胞能够进行大量基因扩增的特点，最终来获得目的基因。（2）构建基因文库的步骤DNA片段的制备

↓

载体DNA的制备

↓

目的DNA+载体DNA的进行基因重组

↓

重组DNA的筛选和鉴定

↓

体外包装

↓

转化

↓

扩增

↓

保存4、逆转录法（1）逆转录法的理由（2）逆转录法的理论依据（3）逆转录所产生的DNA的特性（4）逆转录法的具体步骤（5）逆转录法的实例（4）逆转录法的具体步骤A、mRNA的纯化B、cDNA第一链的合成C、cDNA第二链的合成D、cDNA的克隆和重组E、将重组体导入宿主细胞F、cDNA文库的鉴定G、目的cDNA克隆的分离和鉴定H、阳性克隆的鉴定和验证

mRNA的分离Oligo-dT纤维素柱Oligo-dT磁珠法高盐洗涤，低盐洗脱，2-3次过柱cDNA的克隆和重组（D1）、用于cDNA的克隆的载体当cDNA的插入片段小于10KB时，应选用质粒载体。当cDNA的插入片段大于10KB时，应选用噬菌体载体。表达型是指重组后插入的cDNA能够经过转录、转译，最终合成蛋白质。非表达型是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译，合成蛋白质。

质粒 噬菌体

表达型

pUC

λgt11

非表达型

pBR322 λgt10（D2）cDNA的片段与载体的连接（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法用3-末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA的末端加上polyG（或者polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者

polyA）的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。（2）加人工接头的连接法所谓加人工接头的连接法，是指用采用T4DNA连接酶，在cDNA的末端加上人工接头，然后再使用特定的限制酶来切出粘性末端，从而实现与载体DNA的连接。E、将重组体导入宿主细胞F、cDNA文库的鉴定表型鉴定法：

（1）抗性基因失活法，

（2）菌落颜色，

（3）噬菌斑颜色改变。分子鉴定法：

（1）凝胶电泳、

（2）分子杂交，

（3）DNA序列测定。G、目的cDNA克隆的分离和鉴定（1）核酸探针杂交法根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库分离特异的cDNA克隆。（2）免疫反应鉴定法以某种特定蛋白质的抗体，来寻找相应的cDNA克隆。本法是筛选特异cDNA克隆的重要途径，在没有可供选择的基因表型时，或者在没有合适的核苷酸探针时，利用免疫反应鉴定法可以逐一鉴定各cDNA克隆的表达产物。H、目的基因cDNA阳性克隆的鉴定和验证技术（1）绘制限制性酶切图谱（2）分子杂交（3）基因定位（4）基因测序（5）确定基因的转录方向（6）确定基因的转录起始点成功实例：（1）人生长激素（2）α-人干扰素（3）β-人干扰素（4）人尿激酶。

5、PCR技术法--聚合酶链反应技术（1）聚合酶链反应技术的定义（2）PCR技术的步骤（3）PCR技术的分类（4）PCR技术的特点（5）PCR技术所用到的聚合酶（6）PCR的技术条件（7）影响PCR反应的因素（1）聚合酶链反应技术（A）以mRNA为模板，在逆转录酶有作用下，反转录合成cDNA第一链。（B）不再继续合成cDNA第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异性地合成目的cDNA链的方法。

PCR技术的定义

在四种脱氧核苷酸（dNTP）存在下，以寡聚糖核苷酸为引物，以单链DNA为模板，经过DNA聚合酶催化，最终合成DNA互补链（c-DNA）的过程称为PCR反应。（4）PCR技术的特点PCR技术的优点呈现指数扩增效果。灵敏、快速、简便、特异性强、对样品的纯度无特殊要求，其复制对象可以是DNA、RNA、细胞、发根、活体组织、精子、血液、包埋多年的切片组织、已经绝迹的动物标本的DNA粗提物。PCR技术的缺点：

每掺入9000个核苷酸，就会产生一次错误掺入。

每合成14000个核苷酸，就会产生一次错误的码组移位。（5）PCR技术所用到的聚合酶Klenoe片段特异性较低、对热不稳定、其最适温度为37度，加热会导致其失活，因此在每经过一次PCR循环之后，常常导致碱基错配。Taq-DNA聚合酶来源于一种水生嗜热菌，特异性较高、对热稳定、在95度下不失活，其最适温度为75度，退火温度为55-60度，延伸温度为72度。唯一的不足是不能纠正错误掺入。T4-DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌E.coli。在DNA合成中能够删除错误掺入，非特异性扩增率较低，可用来扩增较大的DNA片段，其催化效率较高，反应速度要比Klenoe片段快得多。（6）PCR的技术条件反应体积：50-100ulPH：8.4Tris-HCl缓冲液：10mmol/L。其中KCl50mmol/L、MgCl21.5mmol/L、明胶100ng/ml。寡聚糖核苷酸引物0.25mmol/L。dNTP

各200umol/LTaq-DNA聚合酶2.5uDNA模板100—10000（约0.1ug基因组DNA）为防止液体蒸发，在液面上加几滴液体石蜡。变性反应：94℃30s

退火反应：55℃30s

延伸反应：72℃60s

循环次数：30次。（7）影响PCR反应的因素（1）引物长度：以15bp--30bp为宜。（2）模板：双链DNA、单链DNA、RNA均可为模板，原料也可以为粗提物。但是不可以含蛋白质、核酸酶、聚合酶抑制剂。（3）Mg2+浓度：以1.5mmol/L为宜。过低则酶活力下降、过高则反应特异性下降。（4）dNTP浓度：以50-200umol/L为宜，过低则产物量下降、过高则容易产生错误掺入。四种dNTP浓度应该相等，否则就容易产生错误掺入。（5）Taq-DNA聚合酶用量：在100ul的反应体系中用量为2.5u。过多则产生非特异性产物。（6）循环参数：应注意反应时间尽量缩短、循环周期尽量控制在25-40次之间，否则，后期酶活力下降，容易产生错掺。四、外源DNA与载体DNA的切割与连接DNA连接目的基因DNA片段与载体DNA，在DNA连接酶（或者在T4-DNA连接酶）的作用下，互相之间通过形成磷酸二酯键，最终构成杂合的重组DNA分子的过程粘结法：具体有插入灭活法、定向克隆法、载体脱磷克隆法、同聚接尾法、双接头法、合成连接一步法。平端接法（加PEG8000/氯化六氨合高钴）（一）、插入灭活法1、定义与方法2、例子3、优缺点插入失活蓝白斑筛选技术根据插入失活原理，筛选重组子。由于外源基因的插入，导致LacZ失去活性，菌落显白色，而未插入重组子的菌落显蓝色。（二）、定向克隆法1、定义与方法2、优缺点1、定义与方法（1）定义利用特异性的单一切点的限制酶，将目的基因按正确方向插入到载体DNA的方法，称为定向克隆法。（2）操作依据质粒载体一般都有多个限制酶的单一切点。（3）方法将外源DNA、pBR322同时用Hihd-III、BamH-I进行切割，那末，外源性目的基因、pBR322载体就会同时产生出Hihd-III粘性末端、BamH-I粘性末端。在进行退火时，外源性目的基因和载体之间就会按照粘性末端互补的原则进行连接。2、优缺点优点在连接过程中，只要外源性目的基因、载体之间粘性末端不互补，就不会产生自身环化现象。缺点：

（1）若外源性基因不能以正确的方向插入到载体之中，则重组DNA在宿主中就不能表达。

（2）反应过程中仍然会产生自身线性聚合体。（三）、载体脱磷克隆法1、定义载体DNA经过限制酶切割之后，再使用碱性磷酸酯酶水解，除去5-磷酰基，然后再与目的基因连接的方法，称为载体脱磷克隆法。2、优点：

（1）载体脱磷克隆法避免了载体DNA的自身环化现象，

（2）也降低了载体DNA的线性聚合现象。

（3）能够提高杂合重组率，也能够提高转化效率。3、缺点无法避免目的基因的自身环化+目的基因的线性聚合现象。（四）、同聚接尾法1、定义2、方法3、优缺点1、定义在载体DNA、目的基因DNA的两端分别接上能够进行互相配对的同一碱基聚合单链，然后进行重组的方法，称为同聚接尾法

2、方法（1）将载体DNA、目的基因DNA分别用限制酶切割。（2）在小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶的作用下，在载体两端3-OH上引入20-30个dG（或者引入50-150个dA）、在目的基因两端3-OH上引入20-30个dC（或者引入50-150个dT）。（3）将混合物进行退火操作。（4）用DNA聚合酶-I补足裂口处缺失的核苷酸。（5）最后，在DNA连接酶的作用下，就可以形成环状重组DNA3、优缺点优点：

（1）对载体、外源性DNA的切割部位无特殊限制。

（2）具有任何末端的载体、外源性DNA均可以通过此法进行重组。

（3）载体、外源性DNA均不产生自身环合现象+线性聚合现象。

（4）方法简单，应用范围广。缺点必须保证接尾后的基因片段中间不能存在裂口，否则，重组后的DNA将没有感染能力。（五）、双接头法1、定义2、方法3、优缺点1、定义在目的基因两端分别接上不同的化学联结器，然后将其与载体同时用二种不同的限制酶进行切割，再将切割产物进行连接的方法。称为双接头法。linker用化学方法合成的、具有某些限制酶专一识别位点的、由8-12个脱氧核苷酸残基组成的单链，称为化学联结器。linker的特性其自身就可以形成互补双链。2、方法双链目的基因DNA

↓DNA酶

（产生出左边的粘性末端）Klenow片段+linker1

↓T4-DNA连接

形成左边的接头

↓核酸酶S1

（产生出右边的粘性末端）

Klenow片段+linker2

↓T4-DNA连接

形成右边的接头+质粒DNA

↓限制酶定向克隆法

形成重组DNA的新质粒。（六）、合成连接一步法1、定义2、方法1、定义以一个载体为引物，在合成含有目的基因互补的c-DNA链的同时，与载体的DNA构成完整的重组DNA分子。这种方法称为合成连接一步法

2、方法具体方法分为以下6步。（1）选定基因工程的载体（2）制备载体引物（3）制备Oligo

dG接头（4）c-DNA的合成与连接（5）形成c-DNA载体的环状单链（6）完成重组（1）选定基因工程的载体选择克隆有真核基因病毒SV40的质粒pBR322，在其SV40区段含有6个限制酶切割位点。[A]、其中Hind-III、Pvu-II位点是SV40-DNA与pBR322-DNA连接成环的嵌合位点，[B]、而Hpa-I、Kpn-I位点，Pst-I、Bcl-I位点则是基因工程的预定切割位点。（2）制备载体引物克隆有SV40的质粒pBR322嵌合体

↓

用Kpn-I限制酶消化SV40--pBR322嵌合体的Kpn-I位点，切开环状的嵌合体DNA

↓

通过末端转移酶+TTP

↓

使嵌合体DNA两端均接上Oligo

dT（T-T-T-T--DNA—T-T-T-T）

↓

再用Hpa-I限制酶切去其中一端的Oligo

dT（DNA—T-T-T-T）

↓

得到一个末端带Oligo

dT的载体引物（3）制备Oligo

dG接头克隆有SV40的质粒pBR322嵌合体

↓

用Pst-I限制酶消化SV40--pBR322嵌合体的Pst-I位点，切开环状的嵌合体DNA

↓

通过末端转移酶+dGTP

↓

使嵌合体DNA两端均接上Oligo

dG（G-G-G-G--DNA—G-G-G-G）

↓

再用Hind-III限制酶切割DNA

↓

最后得到一小段Oligo

dG接头（4）c-DNA的合成与连接PolyA-mRNA+末端带Oligo

dT的载体引物

↓退火

形成杂合链（载体TTT/AAA--mRNA）

↓反转录酶+dNTP

合成带有载体的c-DNA链

↓末端转移酶+dCTP

使c-DNA第一链的两端均尾化为Oligo

dC（C-C-C-C—c-DNA—C-C-C-C）

↓用Hind-III限制酶切除c-DNA的一个Oligo

dC末端

得到含Oligo

dC末端的c-DNA--载体杂合链+一小段Oligo

dG接头

↓退火

形成c-DNA载体的环状单链（第一链）[C-C-C-载体-c-DNA-Oligo

dG-G-G-G]（5）形成c-DNA-载体的环状单链以c-DNA载体的环状单链（第一链）为模板

↓

以四种dNTP为原料

↓

以PolyA为引物

↓

在DNA聚合酶+连接酶的作用下

↓

形成c-DNA载体的环状单链（第二链）[A-A-A-载体-c-DNA-Oligo

dT-T-T-T]（6）完成重组c-DNA--载体的环状单链（第一链）[C-C-C-载体-c-DNA-Oligo

dG-G-G-G]+c-DNA--载体的环状单链（第二链）[A-A-A-载体-c-DNA-Oligo

dT-T-T-T]↓连接酶

形成完整的环状双链重组DNA（合成+重组）合成连接一步法图示含真核基因病毒SV40的质粒pBR322嵌合体制备Oligo

dG接头制备载体引物Oligo

dT形成c-DNA载体的环状单链（第二链）[A-A-A-载体-c-DNA-Oligo

dT-T-T-T]形成c-DNA载体的环状单链（第一链）[C-C-C-载体-c-DNA-Oligo

dG-G-G-G]形成杂合链c-DNAPolyA-mRNA形成完整的环状双链重组DNA（合成+重组）（七）、平端连接法1、定义具有3-羟基、和5-磷酰基的平齐末端的DNA之间，在T4-DNA连接酶的作用下，互相之间通过形成共价键结合，称为平端连接法2、优缺点优点：

（1）本方法是DNA重组中最简单的一种方法。

（2）任何一种平齐末端的外源性DNA片段、和载体之间均可以进行平接法重组。缺点：（1）存在DNA片段的自身环化现象、和DNA线性化现象。

（2）反应速度较慢。只有粘接法的1%。改进：氯化六氨合高钴（1-1.5μmol/L，平端连接效率提高50倍）

PEG8000（15%，提高合成寡核苷酸的连接速率）五、重组DNA的序列分析准确测定方法Sanger双脱氧链终止法：（1）特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、

（2）ddNTP作为链终止剂、（3）聚丙烯酰胺凝胶区分长度差单个核苷酸的单链DNA。

DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP

，4组独立的酶反应，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，每一组酶反应体系里的寡核苷酸将分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每一个G或每一个T位置，通过特定的数学软件最后给出目的基因的测序结果六、宿主细胞的选择和基因导入操作（一）宿主细胞的选择（二）具体的转移技术（三）大肠杆菌中的基因导入和表达（四）酵母菌中的基因导入和表达（五）动物细胞中的基因导入和表达（一）宿主细胞的选择1、宿主细胞应满足的条件2、宿主细胞的类型1、宿主细胞应满足的条件（1）容易获得较高浓度的细胞。（2）能够利用廉价原料进行生产。（3）不致病。（4）不产生内毒素。（5）发热量低。（6）需氧低。（7）具有一定的细胞形态。（8）需有适当的发酵浓度。（9）容易进行代谢调控。（10）容易进行DNA重组技术操作。（11）产物的产量稳定、产率高。（12）产物容易提取和纯化。2、宿主细胞的类型原核细胞类大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。

真核细胞类酵母菌、丝状真菌、植物细胞、动物细胞等。（1）大肠杆菌（2）枯草芽孢杆菌（3）链霉菌（4）酵母菌（5）丝状真菌（6）植物细胞（7）动物细胞（1）大肠杆菌优点：

（1）生长迅速。

（2）分子遗传结构十分清楚。

（3）是目前基因工程研究中使用率最高的表达体系。缺点：

（1）表达产物多为胞内物质，提取时需要破碎细胞。

（2）在进行细胞破碎时，细胞质内的其它蛋白质也会释放出来，形成杂质。给提取带来困难。

（3）所表达的真核蛋白质在其体内常常形成包含体，在提取之后必须经过变性、变性处理才能恢复生物活性。

（4）大肠杆菌中不存在翻译后的修饰系统，不能对蛋白质产物进行糖基化，

（5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白质造成破坏。

（6）大肠杆菌会产生内毒素，难以除去。（2）枯草芽孢杆菌优点：

（1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分泌到培养液中。

（2）不会形成包含体。缺点：

（1）不能使蛋白质产物糖基化。

（2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌系统，常常对蛋白质产物造成破坏。（3）链霉菌优点：

（1）不致病，

（2）使用安全，

（3）分泌能力强，

（4）可将培养产物直接分泌到培养液中，

（5）具有糖基化能力近年来，作为外源基因表达体系，正日益受到人们的重视。（4）酵母菌在各种酵母菌中，以酿酒酵母研究最为透彻。目前，已经有干扰素基因、乙肝表面抗原基因在酵母菌中进行克隆和表达。优点：

（1）是研究基因表达调控最有效的单细胞真核生物，

（2）其基因组小、世代时间短、繁殖迅速、可以利用廉价材料进行大规模培养，

（3）没有毒性，

（4）基因工程操作简单容易，

（5）所表达的蛋白质产物能够直接分泌出细胞外，

（6）能够对蛋白质产物进行糖基化，

（7）真核基因在酵母中表达良好。（5）丝状真菌曲霉被认为一种安全菌株、并且已经对它形成了成熟的发酵和后处理工艺。优点：

（1）有很强的蛋白质分泌能力，

（2）能正确地进行翻译后的加工，如进行糖基化、肽剪切。（6）动物细胞优点：

（1）表达产物可以分泌到培养液中

（2）培养液成份完全由人所控制

（3）所分泌的基因产物接近于天然产物

（4）产物容易得到提纯缺点：

（1）生产慢

（2）生产率低

（3）培养条件苛刻、费用高

（4）培养液浓度较稀(二)具体的基因转移技术1、脂质体介导的融合作用（1）定义（2）脂质体的特性（3）脂质体介导融合的步骤（4）脂质体介导的应用（1）定义将重组的DNA分子包埋于脂质体微囊之中，通过脂质体微囊与宿主细胞的融合作用，而将外源性目的基因转移到宿主细胞内的过程称为脂质体介导的融合作用。（2）脂质体的特性其膜结构与生物膜相类似。（3）脂质体介导融合的步骤（A）人工脂质体的制备（B）脂质体与宿主细胞的融合（A）人工脂质体的制备在含有重组DNA分子的水溶液中+磷脂+吐温80（乳化剂）↓通过激烈搅拌或者超声波处理，将磷脂分散到水溶液之中↓再经过静置，磷脂分子群聚形成液晶态脂质双层薄膜↓将DNA包埋在薄膜之中形成微囊。就是人工脂质体。（B）脂质体与宿主细胞的融合

将脂质体微囊与宿主细胞混合，在PEG、或者在其它促融剂的作用下，经过一定条件就会产生融合作用，最终将重组DNA导入到宿主细胞之中。（4）脂质体介导的应用

对于一些微生物如放线菌细胞，由于无法形成感受态，也就不能通过转化作用导入外源性DNA。但是，通过脂质体介导方法，就能实现脂质体与放线菌细胞之间的融合，来获得基因工程放线菌。2、显微注射技术是在特定的显微镜下，采用特制的微型注射器，将重组的DNA直接注射到宿主细胞内的方法。显微注射技术是一种直接、简单、而又准确、可靠的DNA机械转移技术。3、农杆菌介导的转化Ti质粒有效整合引起的植物功能基因组学研究（三）大肠杆菌中的基因导入和表达1、真核基因导入到大肠杆菌所用的载体2、影响真核基因导入到大肠杆菌的因素1、真核基因导入到大肠杆菌所用的载体（1）pBV220（2）pET系列（1）pBV220是国内使用最多的一个载体，由中国预防医学科学院病毒研究所构建。已经成功地用于表达IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多种细胞因子。[A]、结构[B]、优点[A]、pBV220结构pBV220共3665bp。共由6个部份组成：（1）pUC8的多克隆位点（2）核糖体rrnB终止信号（3）pBR322的第4252-3735位（4）pUC-18的第2066-680位（5）λ噬菌体cIts抑制基因+PR启动子（6）pRC-23的PL启动子+SD序列。质粒pBV220的结构框ori复制起始点

clts857抑制子基因，在31℃时，其基因产物具有阻抑PL的活性，当温度升高时，这种阻抑活性就丧失，PL就开始指导合成mRNA。

PR启动子1

PL启动子2

BglII限制酶切割位点

EcoRI限制酶切割位点

SmaI限制酶切割位点

BamHI限制酶切割位点

SalI限制酶切割位点

PstI限制酶切割位点

HindIII限制酶切割位点，以上切割位点形成多克隆区域，可在此插入外源性目的基因。

RrnB核糖体终止基因（终止子）

PvuI带有青霉素抗性基因Ampr。[B]、pBV220优点（1）可以转化任何菌株，（2）能够防止出现“通读”现象，（3）质粒分子量很小，有利于增加其拷贝数量。（4）能够供插入大片段的外源基因。（2）pET系列pET被认为是最有潜力的系统，来源于T7噬菌体。[A]、克隆宿主可用大肠杆菌K12的HB101、JM103等细胞。pET克隆到宿主体内之后，不会造成宿主的细胞损伤。[B]、表达宿主为BL21（IonompT蛋白酶缺陷）、BL21（λDE3）（IonompT蛋白酶缺陷，表达T7RNA聚合酶基因。表达菌在LB培养基、或者在M9培养基中生长良好。[C]、表达产物可以用金属络合物的方式（镍柱）进行分离，能够达到高纯度、高收率。2、原核表达系统知识介绍一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达，就还需要考虑诱导剂的浓度；如果是融合表达，还需要考虑纯化系统或者蛋白标签的选择和检测等等问题。

选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上，表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合蛋白标签（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等等。复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoEⅠ，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。

2、原核表达系统知识介绍4、筛选标记：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。四环素和氯霉素等等也是常见的筛选标记。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。5、启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR等等，T7是最常用的启动子。6、组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物（用昆虫杆状病毒表达系统）会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。

2、原核表达系统知识介绍7、诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期蛋白过量表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有对细菌有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。

8、融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达蛋白标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的蛋白标签（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择分子量较小的蛋白标签以减少对目的蛋白的影响。FLAG、c-myc、多聚精氨酸、streptagⅡ、Trx-His是最常用的蛋白标签。

9、可溶性表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间表达，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体；而且表达产物如果是可溶的活性状态，那么蛋白就不需要复性。2、原核表达系统知识介绍10、分泌表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合蛋白标签有助于提高产物的可溶性。11、转录终止子：对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用――控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，Rho因子作用下使转录终止、mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止。常见的是rrnB

rRNA操纵子的T1T2串连转录终止12、核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有，适合自带SD序列的基因表达，要留意该现象。2、原核表达系统知识介绍13、表达菌株：往往最容易忽视的一点。不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。同样，交换获得的免费表达用菌株，要注意其遗传背景是否已经发生改变；14、几个常用的启动子和诱导调控表达系统。

T7启动子：是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其以Novagen公司的pET系统为杰出代表。

强大的T7启动子完全专一受控于T7RNA聚合酶，而高活性的T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍——当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白由于大肠杆菌本身不含T7RNA聚合酶，需要将外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7RNA聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式——非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录；通过控制诱导条件控制T7RNA聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。

有几种方案可用于调控T7RNA聚合酶的合成，从而调控T7表达系统

噬菌体DE3是lambda噬菌体的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如