3D成像表征生物打印的卵巢癌模型

/3D成像表征生物打印的卵巢癌模型简介3D生物打印被定义为细胞和生物相容性材料功能性3D结构或人工组织模型。1这项技术更改了组织工程领域，使得创建多而杂的预定义设计的结构成为可能，同时确保可重复性。几种基于3D生物打印的方法已报告用于工程化各种组织，如软骨、2骨、3以及皮肤再生。4该技术也被用于制造新的临床前肿瘤模型。事实上，作为2D细胞培育模型由于缺乏推想性而受到越来越多的质疑，3D生物打印已成为一种替代方法通过处理不同的细胞和细胞外基质衍生分子，肿瘤微环境的建模/呈现（TME）来规避这个问题。很多基于3D生物打印的肿瘤模型包括肺癌、5乳腺癌和6胶质母细胞瘤。7这些模型在设计方面表现出优势，与其他策略相比具有快捷性和可重复性如细胞球和类器官。卵巢癌是一个重点的公共卫生问题，3D生物打印仍作为卵巢癌模型仍在讨论中。在此类肿瘤类型中，显示癌症相关成纤维细胞（CAF）与癌细胞发生紧密相互作用，在癌症侵袭和耐药中发挥紧要作用。8，9因此CAFs是设计卵巢癌模型的关键。优势高内涵筛选和瞬时转染有助于表征和验证3D生物打印试验瞬时基因表达是加添3D生物打印模型的多功能性的有力工具多波长分析工具对于充分利用3D生物打印模型的强大功能进行讨论不同细胞类型群体在模型内的相互作用是必需的在此应用说明中，3D生物打印用于创建包含癌细胞（SKOV3细胞）和CAF成纤维细胞（MeWo细胞）的卵巢癌模型。使用jetOPTIMUS（Polyplus）GFP质粒转染SKOV3细胞和并用CellTracker和OrangeCMRADye（ThermoFisher）将MeWo细胞染色。两种细胞类型均包含在明胶藻酸盐基于水凝胶以获得用于形成圆柱形肿瘤样结构。模型的均相性以及这些肿瘤内细胞分布的可重复性，使用ImageXpressPico进行评估成像系统。结果和讨论如图1所示，生物打印结构成像显示表达GFP的SKOV3细胞和荧光染色的MeWo细胞均质分布于明胶藻酸盐基体（图1A和B）。这特别紧要，由于同质细胞分布均匀分布在生物墨水中是3D打印过程中需要考虑的紧要因素12此外，天然TME是已知包含多种紧密相互作用的细胞类型。13因此，重现这一点至关紧要，同时构建体外肿瘤模型以促进癌症和基质细胞之间的相互作用。而肿瘤中应结合多种细胞类型以更好地模拟TME异质性，每种细胞类型的数量及其比例需要加以掌控以确保可重复性。ImageXpressPico是一个特别适合用于实现此类掌控，因其可以快速轻松地捕获多张显微镜图像。软件CellReporterXpress允许对多个细胞进行定量即使是厚样品，也可使用Zstack的最大投影实现。在此应用说明中，此系统用于分析我们的生物打印肿瘤模型在细胞数量和比例方面显示出良好的可重复性在6个生物打印的结构，SKOV3细胞的平均数量（细胞计数FITC）为837200（标准差≤25%）。对于MeWo细胞（细胞计数TRITC），平均数量为3264.50462（StD≤15%）。图1分析含有转染GFP质粒的SKOV3细胞和经CellTrackerOrange染色的MeWO细胞的3D生物打印结构CMRA染料。A）使用ImageXpressPico系统（4X，Zstack）采集的孔B3中3D生物打印结构的FITC和TRITC图像。B）分析使用CellReporterXpress软件创建的FITC和TRITC细胞计数的掩膜。C）样品的FITC和TRITC通道中的平均细胞数量（5孔，染色和转染）和阴性对比（3孔，未染色和未转染）。D）转染效率的评估，使用GFP质粒和jetOPTIMUSPolyplustransfectiontransfection试剂盒（FITC阳性细胞百分比/TRITC阳性细胞）。本应用说明呈现了可视化可在生物打印中快速察看到特定基因结构。可实现瞬时基因表达，生物打印结构的特定细胞类型转染后再通过生物打印构建将其整合到3D中。这是3D生物打印相较于其他3D培育方法的一个显著的优势，例如已转染的细胞球和类器官的培育具有挑战性。在这个初步试验中，转染效率估量为25%（StD3.48%）（图1D）。还可以进一步优化，例如，通过使用ImageXpressPico可筛选多个浓度转染混合物、DNA质粒量和时间。该方法还供应了进行基因检测的可能性，基质和癌症中的静默和/或基因编辑细胞。总之，我们将转染、荧光成像和细胞计数结合以表征和验证3D含癌细胞和CAF的生物打印卵巢肿瘤模型。我们可以证明两种细胞类型及其基质中的接近度，有利于细胞互动。这种方法为供应了创建具有受控且可重复的细胞分布的更多而杂和完整的肿瘤模型的可能性，且没有在3D模型中察看到的染料渗透的局限性。因此，3D生物打印肿瘤模型可以快速在整合到微流控系统。然后可以长时间培育在生理流下制造更多体内样抗癌药物开发的临床前模型。材料和方法水凝胶制备对于水凝胶制备，所需质量的对明胶和海藻酸钠粉末进行称重，在紫外线下1小时，然后溶解在Dulbecco改良EagleMedium中混合lowest必需培育基（MEM），补充有10%胎牛血清。所得溶液为然后在磁力搅拌下在37℃下保持过夜，complete均质化。细胞转染和染色依据制造商的说明，使用jetOPTIMUS（Polyplus）GFP质粒转染SKOV3细胞。10简言之，适量的DNA稀释至jetOPTIMUS缓冲液并适当的加入jetOPTIMUS转染试剂。转染溶液在室温下保存10分钟，然后添加到培育的SKOV3细胞中，以60–80%融合度培育在T75烧瓶中。使用CellTrackerOrangeCMRA染料（ThermoFisher）对MeWO细胞进行染色，依照制造商的说明。11简言之，将染料溶解在DMSO中制备工作溶液，然后稀释在MEM培育基中。将细胞在37℃孵育30分钟。然后取出试剂溶液，替换为新鲜的complete培育基。图2用于对卵巢癌模型结构进行生物打印和成像的方法示意图。细胞包封对于生物墨水制备，胰蛋白酶消化的细胞重悬于新鲜培育基中并当心添加之前制备的聚合物溶液。获得的缓慢搅拌悬浮液以使细胞均质化的分布在生物墨水中。生物打印工艺将制备好的生物墨水装入3mL滤芯中并装入生物打印头。生物打印在24孔板中进行。每个3毫升滤芯生物打大约48种结构。生物打印后，使用100mMCaCl2溶液交联结构，补充新鲜培育基并在37℃和5%CO2条件下培育，直至试验。细胞成像将生物打印结构转移到96孔板中（Greiner655892，玻璃底，黑壁）。使用ImageXpressPico自动细胞成像系统，使用4X物镜对细胞进行成像。通过透射光、FITC和TRITC通道分别以5、150和250ms曝光时间在每个孔采集图像。4X物镜显示约占孔总面积的40%。接受基于硬件和基于图像的自动对焦相结合的方法，获得了距