基因工程重点总结

基因工程名词解释：基因工程：重组DNA技术或者基因转移技术，在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定的传递和表达。报告基因：其编码产物能够被快速测定，常用来判断外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。双元载体：由两个分别含有T—DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒载体系统。受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源基因的整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。正负选择法：哺乳动物细胞转染DNA发生随机整合的几率相当高，而同源重组的频率则相当低。正是由于这种缘故，给哺乳动物细胞的基因定向插入事件的检测造成了很大困难。用于富集同源重组事件的特殊试验体系，涉及正选择和负选择两个方面。基因靶标：通过在转染细胞中发生的外源基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变系把你遗传特性的目的。密码子使用的偏爱性：无论是真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是以同等频率使用所有的同义密码子，而主要使用其中的某一两种。这种密码子使用的非随机性现象选择标记基因：用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来的基因。主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。HAT选择法：由于选择TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷，所以称之为。生殖细胞浸泡法：将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗悬浮细胞培养物等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并稳定地整合、表达和遗传。胚囊、子房注射法：使用微量注射器把外源DNA溶液注射到子房或胚囊中，由于卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因的种子。启动子：RNA聚合酶识别并结合，从而起始转录的一段特异DNA序列。增强子：增强与之相连锁的基因转录活性的调控序列。先导序列：从真核基因mRNA5’胸苷激酶TK：核苷酸合成代谢途径中的一种酶，能够将胸苷转换为胸苷一磷酸。InPlanta转化：利用花粉粒及花粉管通道、子房、幼穗及种胚导入外源基因。花粉管通道介导基因转化：授粉后，外源DNA能沿花粉管渗入，经过诛心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。愈伤组织再生体系：外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养能获得再生植株的受体系统。直接分化再生系统：外植体细胞越过脱分化阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。用叶片、幼茎、子叶、胚轴等外植体，直接出芽。胚状体再生系统：二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的情况下，模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生过程。生殖细胞受体系统：以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。种质系统。基因枪法，微弹轰击法：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。种质系：合子胚中特定细胞将来分化发育成植物体的特定器官和部位。原生质体的基因转化：以原生质体为受体的基因转化。PEG法、脂质体法、电激法、超声波法、激光打孔法等。脂质体法：用脂类化学物质包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。脂质体：是人工构建的由磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸等组成的双层膜囊。电激法介导的基因转化：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上电激穿孔形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的导入。显微注射介导基因的转化：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核中。激光微束介导的基因转化：将激光引入光学显微镜聚集成微米级的微束照射培养细胞后，在细胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加入细胞悬浮液里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。生物反应器：用于生物反应过程的容器总称。包括酶反应器（游离酶和固定酶）、固定细胞反应器、各种细胞培养器、发酵罐和转基因动植物等。Bradford法：考马斯亮蓝与蛋白质结合产生蓝色，595nm处有最大吸收值。基因水平转移HGT：遗传物质从一个有机体向另一个与供体有性不亲和的有机体转移酵母双杂交系统：将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子的DNA结合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。物理图谱：表示某些基因与遗传标志之间在基因组上的直线相对位置和距离的图谱。遗传图谱：由基因重组测验结果推算出来的、在一条染色体上可以发生的突变座位的直线排列（基因位点的排列)图。染色体步查：从染色体上某一位置（某一DNA克隆）出发，在基因组文库中筛选出与该DNA末端序列有互补序列的DNA克隆，亦即与该DNA一端相邻接的DNA片段一步一步达到靶DNA序列。双分子荧光互补：荧光蛋白切割成两个多肽连接到两个相互作用的蛋白质上重新发出荧光。分子伴侣：阻止副反应保证其他蛋白质的正确折叠的蛋白质。N端法则：生物体内蛋白质的新陈代谢的稳定性主要取决于N端氨基酸的性质。转化受体：高效稳定的再生能力，较高的遗传稳定性，具有稳定的外植体来源，对选择性抗生素敏感，对农杆菌的侵染有敏感性。基因漂移：转基因植物通过花粉漂移或种子扩散将基因转入同一物种或相关物种。瞬时表达：转入的基因在植物当代表达或是分化时表达稳定性表达：转入的基因能稳定的遗传给子代并得到表达核基质附着区MAR：存在于真核细胞染色体中的一段与基质特异结合的DNA序列。简答：真核生物基因在原核生物系统表达的载体的基本组成：强启动子2、转录终止子3、翻译起始序列4、翻译增强子5、翻译终止密码启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞生理特征等都会不同程度地影响克隆基因的表达效率克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位细胞质，细胞周质，分泌到细胞外使克隆基因表达的外源蛋白分泌到胞外的培养基中，是获得蛋白质稳定性的最佳途径。外源蛋白在大肠杆菌中的稳定性蛋白质的降解作用让外源蛋白定位在周质或胞外表达使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长使目标基因以融合蛋白形式表达置换多肽链中的某些氨基酸，清除蛋白酶切点对目标蛋白质作疏水性修饰结构决定因子与蛋白质的稳定性N端法则表达天然的蛋白质以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞中表达外源真核基因有许多方面的优越性分子伴侣的稳定作用指一类多功能蛋白质，能够通过阻止诸如聚合作用这样的副反应，来促使其他蛋白质按正确的方式折叠，而本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成成分。通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌寄主细胞中的共表达是增强目标蛋白的稳定性，实现高水平表达的有效方法。大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性使用胞内蛋白酶含量很低的大肠杆菌突变株，作为表达外源蛋白质的寄主细胞，其中用得最多的是缺失Ion蛋白酶的大肠杆菌突变株。影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素启动子对克隆基因表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影响启动子序列与上述保守序列之间相似程度越高，其表达能力也就越强。两个保守序列之间的距离，接近于17个碱基。启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响5’3）提高克隆基因表达效率的实验方案质粒载体的生物学特性与基因表达效率质粒的拷贝数启动子的强度基因的拷贝数，即基因剂量，最简单的方法是将基因克隆到高拷贝的质粒载体RNAI和Rom蛋白质质粒载体的不稳定性将Par克隆到表达载体对无质粒细胞进行反选择mRNA转录本身的分子特性对基因表达效率的影响翻译起始序列SD序列：许多细菌基因起始密码子5’上游都存在5——10个核苷酸的核糖体结合位点（RBS），包含5’UAAGGAGGmRNA的稳定性mRNA分子的相对寿命，或对内源RNase降解作用的抵抗能力。5’——UTR系列和3’遗传密码子的使用密码子使用的偏爱性细胞中同工tRNA的丰度差异嘧啶碱基结尾的密码子（C或U)之间的非随机选择寄主细胞的生理状态培养基的营养成分、细胞培养方式、以及培养温度和培养基中所溶解的氧等。HAT选择法及其原理由于选择TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷基本原理：如果用叶酸的类似物氨基蝶呤处理细胞，二氢叶酸还原酶便被抑制，培养基中的还原辅助因子四氢叶酸因得不到补充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成dTTP，以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻断，但次黄嘌呤是daATP和dGTP补救合成途径的一种底物。培养基中补加有此种物质时，细胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，由于在HAT培养基中补加有外源的胸苷，所以TK+细胞通过胸苷激酶的作用可把它合成为dTTP，继续存活下去，而TK—细胞则不会发生这种合成，因而死亡。把正常的tk基因导入TK—细胞，它们也就照样能存活下去。所以使用HAT培养基，能够选择出由tk基因转化而来的TK+细胞。正负选择法及其原理转染DNA与内源基因组DNA之间的同源重组事件，是由转染DNA的自由末端激发的。哺乳动物细胞转染DNA发生随机整合的几率相当高，而同源重组的频率则相当低。正是由于这种缘故，基因定向插入事件的检测造成了很大的困难。用于富集同源重组事件的特殊的试验体系，涉及正选择和负选择。正选择：neo基因叫做正选择标记基因，可抑制抗菌素G418的活性。因此，获得的neo基因的转化细胞呈G418抗性，能够在含有G418抗菌素的选择培养基中生长存活。负选择：HSV—tk基因叫做负选择标记基因，它编码的单纯疱疹病毒胸苷激酶，可以把核苷类似物，例如鸟嘌呤(GCV)，转变成毒性的核苷酸，造成细胞中毒死亡。因此，选择培养基中的GCV能够特异性的杀死表达HSV—tk基因的转化细胞。图位克隆：建立目的基因的遗传分离群体找到与目的基因紧密连锁的分子标记用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特定位置构建含有大插入片段的基因组文库以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群通过染色体步移、登陆或跳查，获得含有目标基因的大片段克隆通过亚克隆获得目标的小片段克隆通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列常用的选择标记基因：新霉素磷酸转移酶基因潮霉素磷酸转移酶基因Bar基因EPSP合成酶基因报告基因：GUS基因，绿色荧光蛋白，荧光素酶基因，氯霉素乙酰转移酶基因根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化：对受体的识别浮着到植物受体细胞诱导启动毒性基因类似接合孔复合体的合成和装配T—DNA的加工和转运T—DNA的整合无标记的转化策略：农杆菌介导的共转化法位点特异性重组酶介导的标记基因的切除转座子介导的标记基因的切除MAT载体系统通过染色体内部同源重组来消除标记基因PCR法转化动物细胞（外源DNA导入哺乳动物细胞的方法）：磷酸钙转染法DEAE葡聚糖转染技术聚阳离子DMSO转染技术基因显微注射技术电穿孔DNA转移技术脂质体载体法动物基因工程筛选标记：胸腺激酶基因二氢叶酸还原酶基因氯霉素乙酰转移酶基因细菌的黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因细菌的新霉素磷酸转移酶基因提高外源基因表达的策略：构建高效表达的转化载体克服转基因的失活利用位点特异性重组系统利用去甲基化试剂5—氮胞苷植物基因转化受体系统：愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞再生系统克服质粒丢失的方法：质粒分离的不稳定性指质粒缺陷性分配引起的质粒丢失现象。分配功能区Par能够保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确分离，并均匀的分配到子细胞中去。克服方法：将Par克隆岛表达载体对无质粒细胞进行反选择基因工程的选择标记基因的选择原则：标记基因产物不会干扰受体细胞正常的新陈代谢活动，同时，转化细胞应具有抵抗选择剂的能力。使用的选择剂不明显影响转化细胞的生长发育。选择过程花时短，选择剂的用量低。应尽量选用被证明环境释放安全的选择基因。Bt蛋白的杀虫机制Bt基因编码的内毒素是以无毒的原毒素形式存在，当敏感的昆虫在其取食转基因植物时，Bt原毒素随之进入昆虫的消化道，在昆虫的中肠道被肠胃碱性蛋白酶水解成毒素分子，这种活化的毒素分子与中肠上皮细胞表面的糖蛋白结合，其N端区域插入细胞膜，形成小孔，破坏K通道，引起细胞内外的渗透压失衡，致使细胞因膨胀而破裂，结果昆虫便停止取食而最终死亡。原毒素的溶解，原毒素的蛋白酶水解，毒素分子穿过围食膜，毒素分子与受体结合，毒素分子插入膜中，小孔的形成，中肠细胞失去离子平衡裂解。要证明外源基因成功地在受体生物中整合和表达，应进行哪些检测：外源基因整合分子生物学鉴定PCR扩增，Southern斑点杂交，Southern印迹杂交，Southern原位杂交，PCR-Southern杂交外源基因表达的检测转录水平上：Northern杂交（斑点，印迹杂交）翻译水平上：生化反应检测，免疫学检测，生物学活性的检测利用基因工程控制果实成熟的方法：Met—SAM—ACC（ACC合成酶）—乙烯（乙烯形成酶）ACC合成酶反义基因及其应用乙烯形成酶反义基因及其应用ACC脱氨酶基因及其应用PG反义基因的应用耐除草剂基因工程主要由两种策略：修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或解毒草甘膦草甘膦特异性地抑制植物和细菌中的莽草酸羟基乙烯转移酶（EPSPS）的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途径的一个酶。在植物中，大部分EPSPS的活性中心位于叶绿体中。莽草酸途径被抑制，造成植物芳香族氨基酸的缺乏。EPSPS合成酶的过量表达对除草剂不敏感的EPSPS合成酶除草剂的解读基因磺酰脲类除草剂磺酰脲类除草剂抑制支链氨基酸合成过程中一个关键酶——乙酰乳酸合成酶（ALS）而抑制蛋白质的合成。在植物和微生物中，ALS催化支链氨基酸生物合成中共同的第一步反应。分离对磺酰脲类除草剂不敏感的ALS基因，并转化植物。草丁膦草丁膦强烈地抑制谷氨酰合成酶（GS）的活性而造成氨在植物的积累毒害。乙酰CoA转移酶催化乙酰CoA与草丁膦的游离氨基结合，使草丁膦变成乙酰草丁膦，从而失去除草剂的活性。阿特拉津三嗪除草剂的主要代表，其主要作用是抑制植物叶绿体中的光合作用。与质体醌竞争32kD蛋白的同一结合位点，阿特拉津与32kD蛋白结合后，就被抑制了PSⅡ电子传递中质体醌。利用点突变耐阿特拉津的psbA基因。基因工程建立的基础：理论基础a、DNA是遗传信息的携带者b、DNA能自我复制和传递c、中心法则的提出和遗传密码子的通用性技术基础a、工具酶：限制性内切酶、连接酶b、质粒载体c、受体的转化方法植物来源的抗虫基因转入原始品种或其近缘种往往达不到理想的抗虫效果，简述其原因。昆虫和植物之间存在食与被食的关系，昆虫和植物进行进化，植物来源的抗虫基因对取食昆虫而言类似于抗原，能诱导产生对抗虫基因产物不敏感的靶酶，或超量表达靶酶，或者表达解毒基因，降解抗虫基因的产物。植物病毒载体的应用潜力个别病毒可以较高频率通过种子传递到下一代，可以避开质粒载体转化时的组织培养植株再生的困难。多年生以及那些用营养器官进行繁殖的一年生植物（如土豆），用病毒接种是可行的克隆基因的功能验证密集种植的温室栽培植物如番茄等，用人工接种，在经济上是可以承受的。用植物细胞表达外源基因产物从安全性考虑，理想的转基因方法应该满足哪些条件。不发生基因漂移不影响靶生物，非靶生物和生物多样性不影响农业生态和自然生态环境无标记基因，不影响食品安全动物基因工程的制约因素有哪些动物细胞全能性的局限性动物细胞组织培养的技术限制转基因动物胚胎细胞需放入动物体内才能发育成新的个体，花时长动物繁殖速度一般较慢转化方法的限制载体的限制植物转基因的操作程序外源基因的分离克隆——载体的选择和构建——基因转化受体系统的建立——基因转化——筛选转化体——检测外源基因的表达——表型性状的鉴定——遗传学分析后代——目标性状的传递和稳定性—农杆菌介导的转化：外源基因的分离——克隆到载体上——建立基因转化受体系统——农杆菌的敏感性试验及菌种的选择——外植体的预培养——外植体的接种和培养——选择培养转化细胞——外源基因整合和表达检测——外源基因提高表达策略抗植物病毒的基因工程策略：CP基因及应用复制酶基因及应用病毒卫星RNA的利用卫星RNA的特点;在其相伴病毒中发现按照相伴病毒的复制和传播机制，从一个植株传到另一个植株它们不与其相伴病毒的核苷酸序列同源，对病毒的复制也不起作用卫星RNA能改变其相伴病毒的致病力核糖体失活蛋白RIP的利用一类能抑制蛋白质生物合成的蛋白，广泛存在于高等植物中。Ⅰ型是单链碱性蛋白质，分子量约为30kD，可以带有糖基也可以不带糖基但其生物活性都一样，都具有抑制无细胞蛋白质合成的作用，对完整细胞或动物呈无毒或低毒。Ⅱ型由A、B两条肽链通过二硫键组成的二聚体，其分子量约60kD，其A链与I型同源呈酸性或碱性，是毒性分子，B链是凝集素，能结合到细胞膜表面并协助A链进入细胞。Ti质粒改造策略：一元载体系统：去除野生型Ti质粒T—DNA中的Onc基因，引入一段过程操作的小质粒序列，保留T—DNA的边界序列。将外源基因装载到小质粒上，然后把载有外源基因的小质粒通过一定的方法导入农杆菌，利用Ti质粒与小质粒的同源重组，将外源基因引入T—DNA，制成用于转化的一元载体转化菌株。双元载体系统：大Ti质粒的改造，主要是去除T—DNA上的Onc基因，甚至完全消除T—DNA，保留Ti质粒上的其他部分，并保留在受体菌体中。小质粒只带有T—DNA、复制起点和选择标记基因，有些仍保留VirG序列，并在T—DNA上引入多克隆位点。基因的定点插入技术，通过在转染细胞中发生的外源基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。在外源定点插入基因与内源核基因组目标基因之间，必须存在一段适当长度的同源的DNA序列。插入型和置换型应用基因定向插入技术，能够将体外修饰改造的突变基因或某种新的外源基因，取代受体细胞核基因组上的目标基因，使基因组获得新的遗传信息，以便使科学工作者能够相当有效地检测基因的功能。应用基因定向插入技术，也可以在核基因组的目标基因序列附近，插入一个具相同调控序列的同源基因拷贝。如此，既可形成重复基因，提高表达效率和相关的蛋白质产量，又可能不会破坏目标基因及其邻近基因的功能。利用基因定向插入技术，还可以在核基因组内部增加一段DNA序列，或造成序列缺失，甚至是单碱基定点突变等，从而达到抑制或纠正目标基因的功能，为遗传疾病的基因治疗提供技术途径。动物病毒的特点：动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效地启动子。有许多动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。病毒具有控制自我复制的顺式元件和反式作用因子。有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接收器，因此外壳蛋白可作为感染剂能够将外源基因高效地导入寄主细胞。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒，即构成了一种高效地转化体系。晚期区段取代载体缺失了整个晚期区段功能的SV40病毒，同可互补这段功能的一种温度敏感ts的辅助病毒混合感染时，仍然能够增殖。因此，可以通过取代晚期区段的途径构建SV40病毒载体。最常用的辅助病毒是tsA突变体，它合成一种温度敏感的T抗原。B、早期区段取代载体通过由一种辅助病毒提供抗原，被这种取代载体感染的受体细胞，便会出现正常的裂解周期。重组的病毒——质粒载体含有完整早期区段和复制起点的病毒—质粒载体由病毒的早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重建而成。微型病毒复制子—质粒载体含有SV40复制起点的DNA片段Southern印迹杂交检测转基因植物外源基因整合位点和拷贝数的原理重叠探针杂技，并以转化的外源基因不同拷贝数为对照。转化植株基因组DNA用限制性内切酶消化时，外源DNA序列会产生四种片段。内部片段：由外源DNA内的切点产生边界片段：是外源DNA插入的末端片段复合片段：这种片段与T—DNA的左边界及右边界表现同源重新编排的序列：这种限制性片段可能来自T—DNA的重新编排或异常整合。也可能是正常整合后发生如何评价一个转基因体系的优劣？从外源基因分离和克隆的角度，基因序列是新的，要求有氨基酸的改变从载体的角度，操作简单、安全，对受体不造成伤害，也不影响受体细胞正常的