Mozzarella干酪成熟中蛋白水解及功能特性的变化

-.zMozzarella干酪成熟中蛋白水解与功能特性的变化摘要:为控制干酪的质量,对Mozzarella干酪成熟过程中蛋白质的水解(测定SDS凝胶电泳和可溶性氮)和未融化干酪的质构变化以及融化干酪功能特性变化进展了研究,干酪成熟过程中由于凝乳酶和乳酸菌酶的作用使蛋白水解,从而使pH4.6可溶性氮(SN)和12%TCASN逐渐增加;凝乳酶主要影响酪蛋白的水解范围,乳酸菌及其酶,不但影响酪蛋白的水解范围,而且主要影响酪蛋白的水解深度。干酪中的残留凝乳酶和乳酸菌酶使酪蛋白水解为大分子量的肽段,而乳酸菌酶还可将大分子量的肽段进一步降解为小分子量的肽段和游离氨基酸。由于酪蛋白的水解,使干酪的硬度和弹性下降,融化性和油脂析出性增加,随着小分子量肽和游离氨基酸的增加,干酪的褐变性提高。关键词:Mozzarella干酪;蛋白水解;功能特性0引言Mozzarella干酪是PastaFilata(帕斯特-费拉特)干酪中的重要成员,其成熟过程中,在残留的凝乳酶、乳中的胞浆素和发酵剂乳酸菌的共同作用下,干酪中的蛋白质和脂肪(主要是蛋白质)发生降解[1]。在加工干酪时的乳清排出阶段,大局部凝乳酶随乳清流失,而在热烫拉伸阶段,一局部凝乳酶要失活,尽管如此,仍有一些凝乳酶残留在干酪中。在Mozzarella加工中使用的嗜热发酵剂,由于有蛋白和脂肪的包裹,大局部菌在热烫拉伸之后也不会死亡,所以在干酪的成熟过程中会继续繁殖,菌体自溶后胞内酶释放出来,使酪蛋白发生水解。据Mcmahon报道,由于蛋白质的降解,会造成蛋白胶束构造的变化,进而影响干酪的质构和功能特性。国外对不同工艺参数、不同的凝乳酶、不同的菌种在Mozzarella干酪成熟过程中的蛋白水解进展了系统研究,对控制该种干酪的质量和贮藏稳定性提供了理论指导。中国对Mozzarella干酪的研究刚刚起步,对这种干酪成熟过程中蛋白质水解规律的研究还未见报道,本文以中国黑白花牛乳为原料,采用无盐渍新工艺制得的新型Mozzarella为材料,研究Mozzarella干酪在成熟过程中蛋白质的水解特点和未融化干酪的质构变化、融化干酪功能特性的变化及其相互间的关系,并设计试验模型(模拟干酪),以期将凝乳酶和乳酸菌对干酪成熟的作用区分开来,对于说明Mozzarella干酪的成熟规律,生产适合中国人口味的Mozzarella干酪,控制干酪的质量具有重要的意义。1材料与方法1.1试验材料1)原料乳:新鲜牛乳,来源于中国农科院畜牧所,密度1.030g/mL,干物质含量11.05%,蛋白质含量3.03%,酪蛋白含量2.27%,将脂肪标准化至3.0%,使C/F(酪蛋白:脂肪)=0.76。2)乳酸菌种:唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcussalivariussubsp.Thermophilus)CH9,保加利亚德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckilsubsp.Bulgaricus)LB,来源于中国农业大学畜产品实验室。3)凝乳酶:Stami*1150(CHRHANSEN生产,活力为35000U/g)。1.2主要试剂及仪器pH4.6醋酸盐缓冲溶液,12%TCA溶液。干酪加工设备:自制圆桶形干酪槽(容量50kg),干酪刀,带轧辊的干酪拉伸设备;质构仪(StevensQts25MaterialsEvalutionSystem,美国);稳压稳流定时电泳仪(DYY-Ⅲ型,六一仪器厂);电泳槽(BIOCRAFTBE-210N型,日本);全自动色差计(PC-PIIG型,奥依克仪器公司);Petri氏培养皿;9cm定量滤纸;半微量凯氏定氮仪(天长市沪试仪器公司);万分之一电子天平(1602MP8-1型,德国);电子天平(MP200B型,**精细科学仪器公司)。1.3测定方法干酪的融化性用改良的Schreiber试验法测定干酪的融化性,方法为:用特制打孔器顺着干酪纤维方向取圆柱的干酪样品,其直径为17.6mm,厚7mm。将样品放置于预先铺有滤纸的直径9cm的培养皿内,在室温下回复温度30min,然后将其放入预热至100℃的烘箱内,加热1h取出,在室温下回复30min,测定融化干酪的直径,测4个值,准确到0.1mm,计算平均数,表示干酪的融化性。干酪的油脂析出性传统的脂肪渗漏法经改良用于油脂析出性的测定,方法为:用特制打孔器顺着干酪纤维方向取圆柱的干酪样品,其直径为17.6mm,厚7mm。将样品放置于预先铺有滤纸的直径9cm的培养皿内,在室温下回复温度30min,然后将其放入预热至100℃的烘箱内,加热1h取出,在室温下回复30min,油圈形成,测定油圈的直径,测4个值,准确到0.1mm,计算平均数,表示干酪的油脂析出性。未融化干酪的色泽去掉干酪的包装后,立即用色差计进展测定,用亨特系数表示,以标准白板为标准,测定反射色,同一样品测3个点,求平均值。以L表示亮度,L=100为白,L=0为暗;L值越大,色泽越白。a>0表示红色程度,a<0表示绿色程度;b>0表示黄色程度,b<0表示蓝色程度。干酪加热色泽试验粉碎的干酪放入Φ25×150mm的试管内,在沸水中水浴60min,使用色差计以L、a、b为测色模型,试管的底部被夹紧与测光头密合。每个试管有8个数据被读取,每旋转45°读取一个数据,取其平均值[6]。SDS凝胶电泳参照Yun的方法,经改良而得[7]。10mg干酪参加0.5mL样品处理液中(含有20%甘油、0.2%SDS、0.063mol/LTris-HCl(pH6.8)、6mol/L尿素),再加20μLβ-巯基乙醇(2-ME)和20μL饱和溴酚兰溶液,定容到1mL。浓缩胶和别离胶分别用0.125mol/LTris-HCl(pH6.8)和0.38mol/LTrisHCl(pH8.8)进展配制,均含有0.1%SDS。浓缩胶浓度4%,别离胶浓度12.5%。电泳缓冲液含有0.025mol/LTris,0.192mol/L甘氨酸,0.1%SDS。上样量5μL。浓缩胶局部电流15mA,别离胶局部电流25mA。电泳完毕后,将胶片固定4h(固定液33%甲醇和12%TCA),染色3h(考马斯亮兰G-250染色液含有0.9g考马斯亮兰,1mol/L硫酸,10mol/LNaOH,12%TCA)。1.3.6pH4.6SN(SolubleNitrogen可溶性氮)测定准确称取0.75g干酪,参加25mLpH4.6的醋酸盐缓冲液,将干酪充分磨碎,再用25mL的缓冲液充分冲洗,悬浮液在4000r/min的离心机中离心20min,取上清液定量地移入凯氏消化瓶,进展半微量凯氏定氮,并以占干酪总氮量的质量分数表示。1.3.712%TCASN测定准确称取1.5g干酪,参加25mL12%TCA溶液,将干酪充分磨碎,再用20mL的缓冲液充分冲洗,悬浮液在4000r/min的离心机中离心20min,取上清液定量地移入凯氏消化瓶,进展半微量凯氏定氮,并以占干酪总氮量的质量分数表示。1.4干酪的准备Mozzarella干酪的加工方法:原料乳→过滤→标准化(C/F=0.76)→巴氏杀菌(63℃,30min)→冷却(36℃)→加发酵剂(0.5%)→预酸化(21°T)→加凝乳酶→凝乳→切割→加热收缩(38℃)→排乳清→堆酿(pH5.25)→粉碎加盐→热烫、拉伸(58℃)→成型→冷却→真空包装→成熟(4℃)1.5试验模型(模拟干酪)的制作原料乳的杀菌方法与上述方法一样,然后用0.1mol/L的盐酸将牛乳的滴定酸度调整为22°T,其余步骤与上述干酪加工方法一样,在凝块堆叠阶段,将凝块切碎,分次参加5%的乳酸,直到凝块的pH值到达5.25,以后的加工方法同上。2结果与分析2.1Mozzarella干酪和模拟干酪成熟过程中SN变化分别取Mozzarella干酪和模拟干酪在成熟0、10、20、30、40、50d的干酪样品,测定其pH4.6SN和12%TCASN,结果如图1、图2所示。分析Mozzarella干酪与模拟干酪成熟过程中pH4.6SN和12%TCASN含量变化趋势图可以看出,无论是Mozzarella干酪还是模拟干酪,在整个成熟过程中pH4.6SN和12%TCASN都随着成熟时间的延长而逐渐增加,但Mozzarella干酪中的变化幅较大,说明乳酸菌对干酪中蛋白质的水解起着重要的作用。在模拟干酪中由于只有非发酵剂乳酸菌和其他污染的杂菌(数量很少),所以乳酸菌酶对蛋白的分解程度非常小。而在Mozzarella干酪中,12%TCASN随成熟时间的延长逐渐增加,且变化范围较大,这是由于乳酸菌释放的胞内蛋白酶作用形成的。一般认为pH4.6SN表示蛋白水解的广度,而12%TCASN表示蛋白水解的深度。在Mozzarella干酪中pH4.6SN和12%TCASN随着时间的延长逐渐增高,而且pH4.6SN的增长速度比12%TCASN快,这与Yun和Thunell等人的研究结果是一致的。2.2Mozzarella干酪和模拟干酪成熟中SDS凝胶电泳Mozzarella干酪和模拟干酪在50d成熟中SDS凝胶电泳图见图3、图4。从图3可以看出Zone1和Zone2是凝胶中主要的电泳带,位于凝胶的上方。Zone1包含αS1-和αS2-酪蛋白,Zone2主要包含β-酪蛋白,Zone3包含副κ-酪蛋白,在牛乳中存在κ-酪蛋白,而在干酪中主要是副κ-酪蛋白。αS-酪蛋白和β-酪蛋白的水解片段处在Zone2和Zone3之间以及Zone3以下。从Mozzarella电泳图可以看出,在Zone3以下的小分子量的快速迁移肽随时间逐渐增多,而Zone2和Zone3之间的大分子量的快速迁移肽增加不明显,这是由于乳酸菌发酵剂的菌酶将大分子量的快速迁移肽及时地进一步水解为小分子量的快速迁移肽的结果。从模拟干酪的电泳图(图4)可见,在Zone3以下的小分子量快速迁移肽几乎没有变化,而位于Zone2和Zone3之间的大分子量的快速迁移增加很明显,说明只有凝乳酶将酪蛋白水解为大分子量的快速迁移肽,由于没有乳酸菌继续将大分子量肽降解,所以造成酪蛋白水解物(大分子量肽)的积累。根据酶促反响的动力学平衡,这种积累影响了凝乳酶对干酪酪蛋白的水解,所以模拟干酪中pH4.6SN的上升速度没有Mozzarella干酪中快。在牛乳的泳道中存在κ-酪蛋白,而在制成干酪以后,其中的κ-酪蛋白在凝乳酶的作用下水解为副κ-酪蛋白,使其分子量减小,所以电泳带向下移动。2.3未融化干酪的质构变化未融化干酪的质构特性用干酪的TPA硬度(te*tureprofileanalysis,TPAhardness)、TPA弹性(TPAspringness)和TPA粘弹性(TPAcohesiveness)来表示,分别重复测定3次,取平均值。测定结果制成的曲线图如图5,图6和图7所示。从图5、图6、图7可以看出,随着成熟时间的延长,干酪的TPA硬度呈快速下降趋势;而TPA弹性总体上也是呈下降的趋势,但在成熟的前15d之内下降速度较慢,在15～30d这段时间下降速度最为明显,其后TPA弹性稳定在一定的水平。TPA粘弹性则表现为先下降,后上升的趋势,在成熟的前30d之内,TPA粘弹性呈下降的趋势,在前15d下降速度较慢,在15～30d之间,呈快速下降趋势,在成熟的后一段时间,TPA粘弹性随着成熟时间的延长逐渐增大。未融化Mozzarella干酪的质构的变化与干酪成熟中的蛋白水解有关。Micketts和Olson发现在贮藏6周以后干酪的硬度增加,可能与干酪中的自由水进入Mozzarella干酪的纤维构造中并与蛋白胶束结合有关。在本文研究中,由于采用干盐法所以干酪具有均匀的构造,而且制成的干酪使用真空包装密封在塑料袋内,防止了水分的蒸发,另一方面干酪本身的含水量也较高,所以自由水对TPA硬度的影响不大。这种Mozzarella干酪在贮藏过程中的软化,在其他的研究中也有发现。TPA弹性在整个成熟期间有一定程度的下降,这是由于蛋白质的水解,使蛋白质胶束构造变得薄弱的原因。但在Mozzarella干酪中蛋白水解程度十分有限,所以干酪的弹性仅有微小的下降,这与Renda等人的研究结果是一致的。TPA粘弹性表示用质构仪测量干酪时,第二次压缩所作的功与第一次压缩所作的功之比。Mozzarella干酪的粘弹性在干酪成熟的初期逐渐下降,可能是由于干酪中蛋白胶束构造逐渐变得脆弱,干酪在压缩之后回复性变差的结果。在干酪成熟的后期,由于干酪中的自由水进入蛋白胶束之间,变成不易流动的水,使蛋白分子之间的氢键和范德华力增强,使干酪的压缩回复性得到一定程度的改善,所以干酪的TPA粘弹性又有所提高。关于这一点,还有待实验的进一步证实。2.4未融化干酪的色泽变化在Mozzarella干酪的成熟过程中,L值(Lvalue)随着成熟时间的延长,呈逐渐下降的趋势,说明干酪的白度在下降;而与此同时,b值在成熟的前10d内呈下降趋势,在10～40d之间,b值根本稳定在一定的水平,在成熟的后期,b值有逐渐上升的趋势。未融化干酪的L值逐渐下降,是因为在干酪成熟时,蛋白水解使胶束构造变得脆弱,干酪对光的反射和散射作用减弱,并使蛋白胶束包裹的脂肪渗透出来,由于脂肪中溶解有脂溶性色素,所以干酪的白度下降。在Mozzarella干酪成熟的初期,b值有所下降;随着成熟时间的延长,b值有所提高。这种变化趋势与Michael的结果相一致。这可能是由于在成熟的初期,脂肪和蛋白质之间的相互作用,使干酪的质地较为均匀,所以黄度有所下降,但随着成熟时间的进展、蛋白质的水解,脂肪逐渐从酪蛋白的网络构造中释放出来,使干酪的b值逐渐提高。2.5融化干酪的功能特性Mozzarella干酪的融化特性包括许多指标,其中最重要的是干酪的融化性、油脂析出性和干酪在加热时的褐变性,这些特性与Mozzarella干酪作为Pizza(比萨)配料和再制干酪原料的加热特性有关。根据实验结果制成的干酪融化性、油脂析出性和加热时的色泽变化曲线如图10、图11和图12所示。从图10可以看出,Mozzarella干酪的融化性,随着成熟时间的延长呈上升趋势,在成熟的前20d,上升较明显,在成熟的后期,干酪的融化性有所增加,但速度变慢。在Mozzarella干酪的成熟过程中,干酪的融化性随着成熟时间的延长而逐渐提高,这与Yun等人的研究结果是一致的。这与干酪在成熟过程中的蛋白水解有关,在成熟过程中αS1-、β-酪蛋白在凝乳酶和乳酸菌酶的共同作用下,肽键发生断裂,削弱了蛋白胶束之间的连接,在加热的情况下,蛋白的熵变小,分子之间流动所需的能量变小,所以干酪的融化性逐渐增大。从图11可以看出,Mozzarella干酪的油脂析出性随着成熟时间的延长,呈逐渐上升的趋势,在成熟的前30d,上升速度较快,而后期干酪的油脂析出性根本稳定在一定的水平。由于蛋白质的水解,蛋白胶束的构造变弱,胶