肺炎支原体抗体IgM金标检测试剂盒作业指导书

肺炎支原体抗体 IgM金标检测试剂盒作业指导书1 目的建立肺炎支原体抗体 IgM金标检测试剂盒作业指导书，确保生产过程处于受控状态。2 范围适用于肺炎支原体抗体 IgM金标检测试剂盒相关工序的操作者。3 职责操作人员应严格执行本作业指导书。生产主管负责监督检查。质检部质检员负责抽查执行情况。4 工作内容生产工艺流程图※胶体金制备★胶体抗胶体单克隆体金反金应膜抗体检标检测制备进测记★肺炎支原体重组抗原的表达※NC膜处理兔抗鼠IgG抗体制备

抗原检测NC膜检测

★NC膜包被抗体检测

质装产贴切量卡品分NC检检板条包反测测应膜检测入库注：※ 关键过程 ★ 特殊过程4.2 作业内容4.2.1 胶体金制备（柠檬酸三钠还原法）氯金酸（HAuCl4）水溶液放入三角瓶内加热至沸腾→加热柠檬酸三钠溶液→混匀，搅拌煮沸10至15分钟→待胶体金溶液颜色由蓝→紫→红，冷却即可。金标抗体（反应膜）制备0.1M碳酸钾溶液调胶体金溶液pH8.0-9.0→加入抗人IgM单抗，15分钟后加入聚乙二醇→离心，调532nm测OD值5～10，方阵滴定法选定标记工作浓度→用无纺布浸湿胶体金溶液，干燥、平整，检测。4.2.3 金标抗体反应膜质检将制备好的金标抗体反应膜按 5‰比例抽检，与标准反应膜匹配组装成品，同时与标准成品作如下对照检测：符合率：样品稀释液、阴性质控血清无假阳性，阳性质控血清均呈阳性；反应强度：+/+++（阳性反应线/阴性反应线）；反应时间：30s～5min。确认合格后才能转入下一工序。4.2.4 NC反应膜制备亲和性高分子硝酸纤维素膜→活化处理 12小时→用水洗5次，每次20分钟→室温干燥后→取纯化Cpn重组MOPP抗原和兔鼠IgG抗体溶于10%CS中，浓度均为2mg/ml，用Cpn重组肺炎支原体抗原在 NC膜上包被肺炎支原体抗体阳性检测线→用兔抗鼠 IgG抗体在NC膜上包被对照线→干燥后，用 BS液封闭，H2O清洗后，室温干燥，备用。4.2.5 NC反应膜质检4.2.5.1 常规图形模式检测：将制备好的反应膜按 5‰比例抽检，与标准金标抗体反映膜匹配组装成品，同时与标准成品对照检测；观察阳性、阴性包被线及本底，要求图形规则程度均匀，无遗漏或重复包被。4.2.5.2 均一性、符合率筛选：按 3%比例/批，随机取样，每张 5～10人份，作阴性质控品和肺支阳性血清的阳性质控品检测，无假阳性和假阴性，均一性≥ 98%4.2.6 反应体系组装组装材料材料规格（mm）组装方式反应膜（S1）20无纺布（S2）25，30吸水纸（S3）30金标反应膜（S4）10见图1双面胶带（S5）29，48塑料垫板S678单面胶带S7154.2.6.1 反应体组装程序：在S6塑料基板上贴双面胶带S5（29，48mm）二条；在S5上贴反应膜S1（20mm），S1上下缘距S6上下缘各29mm；在S6上贴吸水纸S3（30mm），吸水纸下缘与S1上缘交接1mm,上缘与S5的上边缘对齐；在S5下端贴无纺布S2-1，其上缘压住S1下缘1mm；在S2-1上平放金标抗体反应膜S4（10mm）上缘对齐；f)在S4上平放无纺布S2-2（30mm）上下缘分别 S4、S6对齐；g)将组装成型的反应体系用电脑可调式切割机切成 4.2mm测试条，装入干燥器，待包装。4.2.6.2 成品包装：每支成品先装聚苯乙烯塑料外壳， 再用镀铝膜包装加干燥剂，附说明书，打批号入库，每批留样 100人份，以备复检．4.2.7 参比品制备4.2.7.1 肺支阳性血清质控品取临床确诊肺支病人（临床症状明显、肺炎衣原体培养阳性）血清15份，间接ELISA测定肺炎支原体 IgM抗体阳性，0D492≥0.3，混合血清加防腐剂,分装-70℃保存。4.2.7.2 肺衣阴性血清质控品取健康人血清（体查健康，培养法和间接 ELISA测定肺炎支原体 IgM抗体均阴性，0D492＜0.10）15份，混合血清加防腐剂 ,分装-70℃保存。4.3 成品检测产品技术要求应符合《肺炎支原体抗体 IgM金标检测试剂盒》产品注册标要求。4.3.1外观4.3.1.1 要求检测条：表面应平整、无划伤、开裂、变形及污渍；检测卡各组分附着牢固、内容齐全；检测卡：外壳应平整，上下盖应均匀合拢，无明显间隙；反应芯试条在外壳内应附着牢固；4.3.1.2 检验在自然光线下，用手感和目力观察方法进行检验。4.3.2 符合率4.3.2.1 阴性符合率4.3.2.1.1要求试剂卡测试肺炎支原体 IgM抗体阴性质控血清 10份，假阳性判断结果不多于1份，符合率应≥90%。4.3.2.1.2 测试a)试剂样品稀释液；测定样品液：肺炎支原体IgM抗体阴性质控血清。测定方法随机从同批待测试剂盒中抽取 10个检测卡，测定阴性质控血清10份。测定时取10μl阴性质控血清加在检测卡加样孔中， 再加100μl样品稀释液，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过 20分钟读结果。c)结果以下结果为合格：检测线不显色，只有对照线显色。4.3.2.2 阳性性符合率4.3.2.2.1要求试剂卡测试肺炎支原体 IgM抗体阳性质控血清 10份，假阴性判断结果不多于1份，符合率应≥90%。4.3.2.2.2 测试a)试剂样品稀释液；测定样品液：肺炎衣原体IgM抗体阳性质控血清。b)测定方法随机从同批待测试剂盒中抽取 10个检测卡，测定阳性质控血清10份。测定时取10μl阴性质控血清加在检测卡加样孔中， 再加100μl样品稀释液，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过 20分钟读结果。c)结果以下结果为合格：检测线和对照线均显色 。4.3.3重复性4.3.3.1阴性重复率4.3.3.1.1要求使用试剂盒检测同一份阴性质控血清 10次，同一份质控血清的阴性判定结果应基本一致，假阳性判定结果不多于 1份，阴性重复率应≥90%。4.3.3.1.2测定随机从同批待测试剂盒中抽取 10个检测卡，测定时取 10μl阴性质控血清加在检测卡加样孔中，再加100μl样品稀释液，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过 20分钟读结果。4.3.3.2阳性重复率4.3.3.2.2要求使用试剂盒检测同一份阳性质控血清 10次，同一份质控血清的阳性判定结果应基本一致，假阴性判定结果不多于 1份，阴性重复率应≥90%。4.3.3.2.2测定随机从同批待测试剂盒中抽取 10个检测卡，测定时取 10μl阳性质控血清加在检测卡加样孔中，再加100μl样品稀释液，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过 20分钟读结果。4.3.4 精密性4.3.4.1 要求每批试剂盒随机抽取10个检测卡样品，用同一份阳性质控血清进行检测， 要求各检测卡的显色应均一。4.3.4.2 测定随机从同批待测试剂盒中抽取 10个检测卡进行检测。测定时取 10μl阳性质控血清加在检测卡加样孔中，再加 100μl样品稀释液，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过 20分钟读结果。4.3.5 稳定性4.3.5.1 要求a）在37C条件下加速破坏试验放置 12天，检测卡的符合率和精密度应符