SOP高效液相色谱法检验操作规程

高效液相色谱法制定[1制定[1期准日期制定部门质管部分发部门质管部1、H的：为了规范髙效液相色谱法操作，特制定本规程分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测谱信号。期检定并符合有关规定4.2.1反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如鼠基键合硅烷和氨基键介硅烷相等)也有使用。止相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂：对映异构体的分离通常类型等)以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化常用于填装微径柱(内径约2mm)。有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的,高效液相色谱法检验操作规稈应选用耐酸的填充剂，如具有犬体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十有机-无机杂化填充剂等。4.3.1垠常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器、其他常见的检测器有荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。蒸发光散检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质量有关;二极管阵列检测器可4.3.3紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时,一般需经对用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分水相环境中不易保持伸展状态，故对十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相屮有筹，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的耍求。萇中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者(小于或等于50%)相对丁身的改变量不超过土30%且相对于总量的改变量不超高效液相色谱法性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。不同，釆用理论板数作为衡童柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图,量出如(以分钟或长度计，卜•同，但应取相同单位)和峰宽(W)5.1.5分离度(R)用于评价待测组分与相邻共疗物或难分离物质Z间的分离程度，是衡量色谱系统效的指标性成分(内标物质或其他难分离物质)的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控制。无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较tRtR2(tR2—tRl)R-------或R=---------------------------------------式中tR2为相邻两峰中后一-峰的保留时间；tRl为相邻两峰中前一峰的保留时间；项高效液相色谱法检验操作规稈5.1.7拖尾因子(T)用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度，应检査待测峰的拖尾Wo.O5hT----------------------峰而积法测定时，若拖尾严重，将彩响峰而积的准确测量。必要时，应在各品种项卜•对拖尾5.2测定法5.2.1内标法按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各校正因子(f)=-------------------------------------------AR/CRAR为对照品的峰面积或峰高；再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测童供试品屮待测成分式计算含量：x含量(Cx)=fx-------------------------------------------A$内/G内式中仏为供试品(或英朵质)峰面积或峰高；G为供试品(或英杂质)的浓度；高效液相色谱法检验操作规稈采用内标法，町避免因样品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。522外标法按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰而积(或峰高)，按下含量(Cx)=CH(A.I/A«)式中各符号意义同上。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量稈的1()%〜25%或其峰面积能准确积分[通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差(RSD)应小于10%；含量在().5%〜2%的杂质，峰面积的液和对照溶试品溶液色谱图上各杂质的峰而积并与对照溶液主成分的峰而枳比较，计算杂质含量。等体积纯溶剂的色谱图II。色谱图1上杂质峰的总而积(包括溶剂峰)，减去色谱图II上的溶剂峰暈注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。高效液相色谱法检验操作规稈用于杂质检査时，由于峰而积归一化法测定误差大，因此，通常只能用于粗略考察供试品中的杂不宜用于微量杂质的检査。5.3.1流动相的制备与保存用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外■可见分光光度法进行溶剂高纯水，可用超纯水器制得或用重蒸佛水。凡规定pH值的发对照品溶液和供试品溶液均应分别配制两份。供试品溶液在注入液相色谱仪前，一般应经适立的0.45i】m(或0.22UU1)滤膜滤过，以减少对色谱系统产生污染或影响色谱分离。应根据试验耍求和供试品的稳定性，设置待测溶液的贮存条件(如温度、遮光等)。根据实验要求利流动相的pH值范围，参照色谱柱说明书，先用适宜的色谱柱。安装色谱柱时应使流动相流路的方向与色谱柱标签匕箭头所示方向一致。除另有规定外，合要求。动都会影响柱内固定相的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流动相试验结束后，可按色谱柱的使用说明书，对色谱柱进行冲洗和保存。 高效液相色谱法检验操作规稈流动相纽分比例时，以组分比例较低者(小于或等于50%)相对改变量不超过±30%且绝对改变量药品质量标准屮，通常制备杂质限度相当浓度的对照溶液，用以调节检测灵敏度，使对照溶液的主成分色谱峰相混溶的溶剂不能用作剃度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使混合溶剂的