水稻抗病基因的研究

-第=Page2*12页共=NumPages2*12页.z.**理工学院论文水稻稻瘟病生物学特征及其相关致病基因的研究[摘要]：稻瘟病病原菌为子囊菌Magnaporthegrisea，了解Mgrisea的致病机理不仅有利于稻瘟病的防治，而且作为研究植物病原真菌与寄主互作的理想模式系统，对于了解其它真菌的致病机理也有重要意义。本文重点介绍了关于稻瘟菌的生活史及其局部致病基因的作用机制。[关键词]：生物学特征生活史基因危害研究展望1.引言稻瘟病是世界稻区的主要病害，我国稻区每年也有不同程度的发生。在有利于发病的条件下，严重发病的田块，产量损失高达80％，甚至颗粒无收。种植抗病品种是防治此病最经济有效的措施。但由于稻瘟病致病菌的不断突变导致其具有繁多的生理小种类型，即使是抗病品种往往在种植3～5年后也会丧失对其抗性，由抗病变为具有新型生理小种的感染株。关于水稻抗性丧失的原因，通常认为主要有两个：一是由于在鉴定抗病品种时所选用的菌株不能代表其群体毒性组成特征，不能鉴定出潜在毒性小种，以致大面积推广后，潜在毒性小种上升为优势小种，使品种丧失抗性；二是由于稻瘟病菌发生变异，出现了毒性强的生理小种使品种丧失抗性[1]。稻瘟病病菌生理小种在自然界中易于变异，具有多变性，给水稻生产带来很大的危害，故作好稳定化选择，对稻瘟病防治十分重要。2.稻瘟菌致病菌的根本生物学特征稻瘟菌是单倍体异宗配合的子囊菌，细胞单核。稻瘟菌生活史主要由无性分生孢子和有性子囊孢子的产生以及营养生长等过程组成。目前在自然界尚未发现它的有性阶段。裂殖是稻瘟菌菌丝营养生长的主要方式，菌丝以无丝分裂的方式分化，从而形成无色、细长，不分枝且有弯折的分生孢子梗。每个成熟的分生孢子梗上面有8～10个合轴排列的分生孢子(ShiZandLeungH.,1995)。稻瘟菌有两个交配型MAT-1基因和MAT-2基因，有性子囊孢子是由不同的交配型的菌丝相互融合并以减数分裂方式产生的。一般情况下，在体外培养基上用不同交配型的菌株进展杂交，15～20天左右可以在两个菌株的交界处产生黑色有喙呈圆盘状的子囊盘，上面着生有无数的长条形的子囊。每个子囊里面有8个子囊孢子，每个孢子由4个细胞组成，为半月型呈透明状。稻瘟菌除了主要侵染水稻引起稻瘟病，还可以侵染水稻近缘的50余种禾本科植物如大麦、小麦、黍等作物和马唐、稗、画眉草及一些牧草和草坪草的叶片和颈杆以及根部从而引起草瘟病[2]3稻瘟病生活史稻瘟病菌是异宗配合的子囊菌，菌丝体为单倍体，无性繁殖产生分生孢子，成熟的分生孢子成梨形，有3个细胞。其侵染循环始于分生孢子与寄主外表的接触，在湿润条件下，孢子尖端释放出一种复合碳水化合物，即孢子尖端粘液(STM)，该物质能以非特异性的形式将分生孢子附着在蜡质的寄主外表，结实地将分生孢子与基质粘在一起。稻瘟病菌的这种附着机制的优势在于：一是不需要消耗代谢能量就可快速地使分生孢子附着在植物外表；二是分生孢子的附着能抵抗水流的冲洗(Hameretal，1988)。分生孢子接触到水30--90分钟后即可萌发。通常情况下只从分生孢子顶端或基端细胞中产生单个芽管，中间细胞很少产生(Bourettetal,1992)，但在外源营养丰富的条件下．分生孢子的任一细胞都可产生芽管。芽管随后的生长和分化依赖于其所接触外表的特性。芽管延伸到一定长度后其顶端膨大成圆形的附着胞。附着胞借助于胞内产生的机械压力穿透寄主外表,侵染钉在穿透植物角质层和细胞壁后，膨大形成初级侵染菌丝，随后分化成次级侵染菌丝，导致在亲合性互作中病害的开展[3]。4稻瘟病菌的变异机制稻瘟病菌变异的原因有4种：1，自身突变和外界诱导，2，异核现象，3，准性重组4，寄主的定向选择[5]。突变快速变异使水稻新品种在推广3～5年后就出现新的稻瘟菌优势小种的原因，现有几种推测，有科学家观察到有些病菌的毒性突变频率为10-2～10-4，这也许是新的生理小种出现的原因之一。有些菌株的突变率可达0．05％，这种病菌*些性状的高频率变异暗示着可能有一种尚不清楚的的机制的参与。在稻瘟尽管稻瘟菌致病性变异的机制尚不清楚，但人们确实在室内观察到无毒基因的缺失、点突变及其外源片段的插入都可使其致病性发生改变。即由对水稻品种的无毒性变为毒性。AVRI．C039控制对水稻品种C039的无毒性，但它不存在能侵染水稻的稻瘟病菌别离物GUYIl中，对GUYll中AVRl．C039缺失位点的分子分析说明，分别位于AVRI-C039缺失位点左右两端的反转座子RETR05和重复元件REPI都有局部缺失现象。有些毒性基因位于染色体端粒附近．端粒的不稳定也可能是*些毒性小种产生的原因。如位于端粒附近的AVR-Pita，其ORF的终止密码子距染色体末端重复序列只有48bp，具有很高的突变率，在此位点上由无毒性转化为毒性的自发突变体中，60％是由于染色体的端部缺失造成的[4]。5稻瘟病菌的致病相关基因稻瘟病菌对水稻的危害及其侵染过程在真菌中的典型性吸引了大批的研究者。近年来稻瘟病菌分子生物学研究取得了长足的进展，主要包括基因组草图的绘制和大批功能基因，特别是致病相关基因的克隆和功能分析。5.1参与产孢过程的基因[稻瘟病菌是异宗配合的子囊菌，在田间存在有性融合，产生子囊壳，但有性后代在侵染循环中的作用可能微乎其微，在自然条件下有性态对稻瘟病菌致病性的奉献可以忽略。因此构成致病性的因素首先是分生孢子的产生。通过筛选致病性减弱或消失的突变子，发现并鉴定了许多参与孢子形成的基因。MACl基因MACl基因的突变使稻瘟病菌生长速度、产孢量、萌发率下降，，突变子在诱导外表上不能形成附着胞，没有致病性。添加外源cAMP可以弥补内源性cAMP的缺乏，恢复MAC1突变子的附着胞形成能力。另外，稻瘟病菌MACl基因也可以恢复脉孢菌腺苷酸环化酶突变子的功能。APFl基因APFl基因是在研究二个稻瘟病菌菌株的杂交后代中一个无致病性的突变子中发现的。该基因对于孢子的形态和附着胞产生能力有多种影响。APF1菌株的孢子在诱导性疏水外表不能产生附着胞，cAMP也不能恢复其附着胞形成能力。因此推断，APFl基因可能在cAMP信号途径下游起作用，或在一个非cAMP依赖性的附着胞分化途径中起作用。另外，APF1缺失突变子不能通过注射到水稻叶鞘方式感染水稻，说明这一基因也参与稻瘟病菌侵入后的生长过程。5.2附着胞分化和成熟过程中的功能基因附着胞分化相关基因附着胞的分化受到多种环境理化因子的诱导，环境因素的刺激通过跨膜受体进入细胞内，再经过多种信号传导途径进入细胞核，相关基因表达，启动附着胞分化形成过程。MPSl基因MPSl基因调控附着胞的功能和其它的可能过程。MPSl缺失突变子可形成附着胞，但不能发挥正常功能，不能够致病，说明MPSl与附着胞的侵入过程有关。MPSl还与致病菌的营养生长、产孢和子囊壳形成有关。OSMl基因OSMl基因调控高盐胁迫下细胞内容物的基因。OSMl是S．cerevisiae中HOGl的同源物，可以弥补HOGl缺失突变子的缺陷使其在高盐浓度下生长。在高盐溶液中，M．grisea菌丝细胞中阿拉伯糖醇迅速积累，附着胞中也有类似的变化。在高盐浓度下HOGl缺失突变子孢子可形成大量的附着胞。说明OSMl确在M．grisea附着胞形成过程中起作用，但这种作用可能负面的：在胁迫条件下，0SM1抑制PMKl-MAPK途径，阻碍附着胞的形成；但同样条件下，HOGl缺失突变子中PMKl因缺少OSMl的抑制而持续作用，仍会形成大量附着胞。附着胞成熟过程中的功能基因成熟的附着胞细胞壁积累大量的黑色素，有效的阻止内容物的渗出；内部积累大量的甘油，产生强大的渗透压，为侵入提供能量。附着孢的成熟离不开黑色素与甘油的合成。黑色素合成相关基因3个黑色素生物合成基因(ALBI，RSLl和BUFl)的克隆从分子生物学角度证明了黑色素层对于附着胞功能的重要性。这些基因中任何一个发生突变后，稻瘟病菌都不能合成黑色素，而产生没有功能的附着胞，失去致病性。但当通过注射直接接种到叶片组织中，都具有完全的致病性。ALBl基因编码一种多聚乙酰合成酶，参与黑色素合成反响的第一步。RSYl基因编码scytalone脱水酶，RSYl和BUFl基因分别调节局部脱水和复原过程。经过研究，BUFI突变子没有致病性，但还能够产生scytalone。甘油合成相关基因附着胞内部可以积累大量甘油，目前对高浓度甘油的积累过程尚未完全清楚。但可知其中NTHl基因编码中性海藻糖酶，该基因突变后，产孢正常，可形成附着胞，但附着胞的膨压降低，突变子不能穿透寄主表皮。TPS1基因编码的海藻糖酶催化形成海藻塘-6-磷酸，该基因突变后，糖酵解途径失调，突变子附着胞的膨压降低，致病性丧失。ICLl基因编码异柠檬酸裂解酶，是乙醛酸循环中的关键酶，该基因突变后，稻瘟病菌致病性降低，但不十清楚显。在CPKA基因的突变子4CPKA中，糖原、脂类的生物降解严重推迟。而脂质体和糖原颗粒的起始运动受到PMKl基因的调节，显示控制附着胞起始分化的相关信号途径也调节附着胞的成熟及其生物学功能。随着附着胞的成熟，孢子逐渐干瘪，其内容物转移到附着胞中。附着胞的形成和甘油积累是孢子内物质的转移，转化和再利用的过程。研究组在研究中发现与细胞自噬相关的蛋白激酶参与的稻瘟病菌的致病过程。该基因突变，使稻瘟病菌产孢量下降，附着胞形成率降低，致病性减弱。推测该基因可能与附着胞形成过程中孢子内容物的分解和细胞器的解体过程相关。5.3侵入栓形成及侵入相关基因在感病品种和抗性品种上，稻瘟病菌都可形成正常的附着胞。而且在非寄主的植物(如，洋葱)表皮以及人工疏水基质上诱导形成的附着胞，与寄主表皮上形成的一样。水稻叶片外表所具有的附着胞形成所必需的的理化特性，如疏水性、外表硬度、角质单体及蜡质层等，在其它植物表皮外表也存在，因此，附着胞的形成是非特异性的。而稻瘟病菌的致病性是特异的，对于特定的致病小种，仅可在特定狭窄范围的品种上发病。因此推断田间稻瘟病菌致病性的变异(小种的变异)发生在侵入和扩展阶段。在这种意义上讲，在基因水平上研究此过程，对了解稻瘟病菌致病性变异的本质更重要。在稻瘟病菌中，侵入栓的形成需要肌动蛋白定位于菌丝的顶端以及在穿透寄主角质和表皮细胞时迅速形成细胞壁。目前，在分子水平上对稻瘟病菌侵入过程的研究还不多。有6个基因与此过程相关。CPKA基因编码依赖cAMP的蛋白激酶亚基，可形成具有相当膨压的附着胞，但不能有效地穿透寄主表皮。MPSl基因编码MAPK激酶，该基因缺失突变子的气生菌丝生长减少，产孢量下降，对真菌细胞壁降解酶高度敏感。其孢子可以形成附着胞，但不能侵入寄主的表皮细胞，然而可以从寄主表皮的伤口侵入，或在没有表皮的叶肉组织上形成稻瘟病的病症，推测该基因的功能与菌丝细脆壁生物合成的完整性、细胞壁在侵入过程中的重建以及细胞极性的形成有关。在侵入栓形成的早期阶段，与植物表皮直接接触的半透明且缺少细胞壁的附着胞孔，在细胞壁合成和菌丝延长之前需要扩大，侵入栓的形成可能导致严重的质膜胁迫(Howard，1997)。因此，保持质膜功能完整的基因(如MPSl，PLSl，PDEl等)，与形成正常功能的侵入栓相关。PLSl可能为稻瘟病菌穿透过程中附着胞基部肌动蛋白细胞骨架的重组所需，对保持生物膜磷酸配基团的不对称性和流动性非常重要。PDEl基因在稻瘟病菌萌发的孢子和正在形成过程中的附着胞中表达，可能在产生具有功能性的侵染菌丝中起着关键作用。5.4侵入后菌丝分化及扩展相关的基因稻瘟病菌的侵入栓侵入寄主开场分化形成侵染菌丝，是病菌与寄主建立寄生关系的关键时期。与侵入后的扩展有关的有ABC1基因，ABC1基因的突变子大大降低了病菌侵入寄主体内后的存活能力，致病性下降。因此，ABC1基因的作用可能是提高了病菌忍耐寄主产生的防卫物质的能力。伏鲁宁体(Woroninbody)是一种起源于过氧化物酶体的细胞器。稻瘟病菌中He*l的蛋白编码基因MVPl，在致病过程中起着重要的作用：对于附着胞的发育和功能，以及侵入和扩展过程中侵染菌丝的在寄主组织内的存活是必需的(Soundararajaneta1．，2004)。伏鲁宁体的功能是给稻瘟病菌提供一种保护机制来应对植物体内的防卫反响和营养缺乏的环境。5.5其他相关基因以上基因除外，稻瘟病菌中还有大量与致病性相关基因已经被克隆和鉴定。如黑色素对于稻瘟病菌的影响，黑色素层对于附着胞功能的重要性已经从遗传学上得到了证明。目前已经别离了3个参与稻瘟病菌黑色素合成的基因：ALBl，RSLl和BUFl。这些基因中任一个基因发生突变的突变子都不能合成黑色素，都产生没有功能的附着胞，都没有致病性。但当直接注射接种到叶片组织中，都具有完全的致病性。6水稻抗瘟基因的定位与克隆20世纪60年代以来，稻瘟病抗性基因的开掘和利用一直得到各国科学家的广泛关注，而现代分子生物学技术的应用加速了这一领域的开展。到目前为止，已经鉴定了70多个抗稻瘟病基因，其中有超过40个被定位，并且Pib、Pita、Pi2、Pi5、Pi9、Pi36、Pi37、Pid-2、Piz-t、Pikm共10个基因已经被别离克隆[7](表1表1已被克隆的基因[抗性基因供体染色体参考文献Pi-251736[13]Pi-ta(Pi-4)Tetep12[10]Pi-5Moroberekan9[12,24]Pi-9小粒野生稻6[11]Pi-36Q618[14]Pi-37St.No.11[15]PibBL12[9]Piz-tToride6[13]Pid-2地谷6[16]Pi-km目前对稻瘟病主效抗性基因的研究较多，基因的定位和克隆也集中在主效基因方面。截至2021年11月，至少已定位了多个稻瘟病抗性基因，超过半数的基因以基因簇的形式分布于水稻的不同染色体区域，其中，最大的3个基因簇分别位于水稻的第6、11和12染色体上。1992年，Mackill首先发现并命名了Pi-1和Pi-2(t)，将其分别定位在第11染色体和第6染色体上。随后，Hittalmani将Pi-1进一步定位在标记RZ536与Npbl81之间，遗传距离分别为7．9和3．5cM，同时将Pi-z5定位在Rz612与RG64之间，图距分别为7．2和2．1cM。目前，Pi-l被多个地区认定为广谱、高抗基因9。表2已定位的稻瘟病抗性基因10基因染色体编号供体品种标记类型连锁及等位状况等位状况Pi-aPi-fPi-kPik-hPi-tPi-zPi-dl(t)Pi-1Pi-6Pi-7Pi-8Pi-10(t)Pi-11Pi-12Pi-13Pi-14Pi-15Pi-16(t)Pi-17(t)Pi-18Pi-19Pi-20Pi-21Pi-21〔t〕Pi-22(t)Pi-23(t)Pi-24Pi-25Pi-26Pi-27(t)Pi-33Pi-34Pi-35(t)Pi-38Pi-39Pi-40Pi-41Pi-44(t)Pib1Pi-CO39Pi-h-1(t)Pi-tq1Pi-tq5Pi-tq6Pi-lm2Pi-GD-1Pi-GD-2Pi-GD-3Pi-g(t)Pi-y(t)Pi-zy(t)111111111621112116581162927111212412651266181111112612111111126212118101221111AichiAsahiSt.No.1KusabueK3K59Fukunishiki地谷LACApuraMoroberekanKasalathTongil窄叶青8号红脚占魔王谷魔王谷GA25Aus373DJ123Suweon365AichiAsahiIR24OwarihatamochiSuweon365Suweon365Suweon365中156谷梅2号谷梅2号Q14IR64Choubu32Hokkai188TadukanQ15澳洲野生稻93-11MoroberekanModanCO39红脚占特青特青特青Lemont三皇占2号三皇占2号三皇占2号Guangchangzhan云引子预44RFLPAllelismtestSSRSSRRFLPRFLPRFLPRFLPRFLPRFLP/RAPDRAPDRFLPIsozymeMakerIsozymeMakerCAPSIsozymeMakerIsozymeMakerRFLPAllelismtestRFLPRELP//SSRRGARGASSRSSRSSRSSRSSRSSRSSRSSRRFLPRFLPRFLPRFLPRFLPRFLP/SSRSSRSSRSSROpZ11-f,RGA-IR14,RM120/RM1233(1.6cM)RM224(0.2cM)RM224(0cM)R1613(0cM)Z56592(0cM)G1314A(1.2cM),G45(10.6cM)RZ536(7.9cM),Npb181(3.5cM)RG869(15.3cM)RG103A-RG16之间5-10cM/RRF6(3.8cM),RRH18(2.9cM)BP127A(14.9cM)RG869(5.1cM)/CRG5-CRG2RZ536(5.4cM)*Nph88(1.0cM)G271(5.0cM),G317(8.5cM)RG869/RM164(19.4cM);RM249(23.9cM)RG241A(0cM)A7(1.7cM)，RG456(1.5cM)B10(5.7cM),R674(25.8cM)RM151(12.1cM),RM259(9.8cM)Y2643L(0.9cM),RM72(0.7cM)C1172-C30038RM1216-RM1003RM21-RM206RM27933(0.09cM),RM27940(0.18cM)RM527(1.1cM),RM3330(2.4cM)RM28130(0cM)AF349(3.3cM)C189(1.2cM)S2712(1.0cM)RG869(5.1cM),RG(6.5cM)C236-RG653RG520-RZ446bRG869-RZ397R4-RZ536*LRfr-8(3.6cM)R16(3.9cM)RM179(4.8cM)RM166(4.0cM),RM208(6.3cM)RM202(3.8cM)RM206(0cM)/与pi-k基因以15%的重组发生连锁Pi-kg(t)、Pi-k3、Pi-kp、Pi-kg(t)、Pi-k3、Pi-kp、//////与基因Amp-3和Pgi-2连锁与RG13严密连锁//与基因Amp-3连锁与基因Amp-1连锁与Pi3/5严密连锁或等位与基因Amp-1连锁与基因Est9连锁/跟Pi-ta2跟Pi-ta2//可能与Pi-2等位///可能与Piz等位/////////////可能与Pi-b等位////////7稻瘟病菌生理小种研究的展望稻瘟病致病菌生理小种分布有地理上的分布规律和年际动态变化，其分布与菌群的丰富度有密切关系。菌群密度越大，则稻瘟病菌的生理小种的数目和种类也就相应增长。在在**省稻瘟病菌生理小种的地理分布中：赣东北稻区出现的小种总数最多为26个，其次为赣中稻区20个，赣南稻区17个，赣北与赣西稻区均为10个小种[11]。小种由于个体之间存在着个体差异故其年际变化不可防止。往往存在着具有显著致病性差异的致病小种。有主要优势种和相应的劣势种，致病性存在很大差异。同样在北方由于与南方水稻一年内种植次数不同所以北方和南方有差异。以**地区为例：在**各区县种植方式根本一样，但随种植年限的增加，不同稻种对生理小种的抗性逐渐降低，生理小种成为优势种[12]。在稻瘟病菌生理小种数量多变异快，生理小种的组成和其中的优势生理小种因地区而异，也随着当时当地的年份季节差异而有不同的特点，不断升级换代，加上国内各稻区所种品种不同，南北籼粳水稻种类差异很大，其生理小种组成也有不同类型。建立一套行之有效，有据可循的对照系统则就显得十分重要。7.1单基因鉴别体系的构建假设要准确鉴定稻瘟病菌的生理小种致病型以及致病型与基因型的关系，就需要建立一套单基因的水稻近等基因系的生理小种鉴别体系。这套鉴别体系应当包括已经发现和命名的全部抗病基因利用这套为数众多的单基因近等基