化妆品菌类检测剖析

-.z.化装品中菌类的检测一、菌落总数的检测1.检测菌落总数的意义菌落总数(aerobicbacterialcount)是指化装品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等)，1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进展卫生学总评价的综合依据。2．操作步骤及检验结果〔1〕检验步骤①用灭菌吸管吸取1:10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100检液。吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，1:10000，……等，每种稀释度应换1支吸管。②将融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，参加约15mL③为便于区别化装品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中参加1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化装品的颗粒颜色无变化。〔2〕菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。假设平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。假设片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。〔3〕菌落计数及报告方法①首先选取平均菌落数在30～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数(见表1中例1)。②假设有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，假设其比值小于或等于2，应报告其平均数，假设大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数(见表1中例2及例3)。③假设所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例4)。④假设所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1例5)。⑤假设所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例6)。⑥假设所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10CFU。⑦菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见表1报告方式栏)。在报告菌落数为"不可计〞时，应注明样品的稀释度。表1菌落计数结果及报告方式例次不同稀释度平均菌落数10-110-210-3两稀释度菌数之比菌落总数CFU\ml或CFU/g报告方式CFU/mL或CFU/g1136516420─1640016000或1.6×10422760295461.63800038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044不可计4650513─513000510000或5.1×105527115─270270或2.7×1026不可计30512─3050031000或3.1×1047000─＜１×10＜10＊CFU：菌落形成单位。二、粪大肠杆菌的检测1.检测粪大肠杆菌的意义大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表*一个或*一属细菌，而指的是具有*些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示化装品中有否粪便污染。大肠菌群数的上下，说明了粪便污染的程度，也反映了对人体安康危害性的大小。是重要的卫生指示菌。2.检测粪大肠杆菌的生化特性粪大肠菌群为一群需氧及兼性厌氧的菌群，呈革兰氏阴性反响，能在普通培养基上生长繁殖。其生化活动能力较强，能发酵多种糖类，产酸产气，其特点是能较快发酵乳糖。

粪大肠菌群在乳糖培养基中于37℃下进展培养，在24h内能使乳糖发酵产酸，还有甲酸氢酶进展甲酸分解，生成氢气和二氧化碳，产生大量气体，这时，假设参加伊红美蓝指示剂，分解乳糖所产生的酸(带正电荷)与伊红相染呈紫色且有金属光泽，故常用此特征来鉴定识别粪大肠菌群。将粪大肠菌群接种于蛋白胨水培养基中，于373.检验操作及结果报告〔1〕操作步骤①取10mL1:10稀释的检液，加到10mL双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃±0.5℃培养箱中培养24②如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18h～24h。同时取该培养液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，外表光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。③挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。④在蛋白胨水培养液中，参加靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反响。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反响液面呈试剂本色。〔2〕检验结果报告根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。三、绿脓杆菌的检测1．检测绿脓杆菌的意义

绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)为革兰氏阴性细菌，属假单胞菌属。它在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力比其他细菌强，抗枯燥的能力也强。

含水分较多的原料、化装品易受其污染，绿脓杆菌对人类有致病力，常引起人体的眼、皮肤等处感染，特别是烧伤、烫伤及外伤患者感染上绿脓杆菌常使病情恶化，严重时可引起败血症，眼睛受伤感染后可使角膜溃疡并穿孑L，严重可致失明。目前，该菌已是防止医院感染和药品、化装品及水等必须严加控制的重要病原菌之一。我国化装品卫生标准规定：在化装品中不得检出绿脓杆菌，因此，在化装品中检测绿脓杆菌具有重要意义。

2．绿脓杆菌的生化特性

绿脓杆菌是革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，能在普通培养基上生长繁殖，为需氧及兼性厌氧类细菌。绿脓杆菌能代谢产生一种绿色的水溶性色素，使培养基变成绿色，受它而引起的化脓感染，脓液就常带绿色，因此而定名为绿脓杆菌。

绿脓杆菌可分解葡萄糖；对明胶具有液化、溶解作用；能复原硝酸，盐成为亚硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氢气；绿脓杆菌具有氧化酶(靛基氧化酶)能将试剂(盐酸二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺)氧化成红色的醌类化合物；还可在42℃的温度下生长繁殖。绿脓杆菌的这些生化特性常用来作为别离和鉴别它的方法。

3．检验操作及结果报告

(1)检验操作步骤

增菌培养：取1:10样品稀释液10mL加到90mLSCDLP液体培养基中，置37℃进展24h别离培养。该类培养基选择性强，大肠杆菌不能生长，革兰氏阳性菌生长完全受到抑制。观察培养基上所形成的菌落，典型绿脓杆菌菌落特征是菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，外表湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩*有水溶性色素。

证实试验：

①染色镜检：取上述可疑为绿脓杆菌的菌落，进展革兰氏染色、镜检试验。

②氧化酶试验：挑取可疑菌落(同上)置于滤纸片上，滴加一滴新配制的5％二甲基对苯二胺试剂，15~30min内，出现红色至紫红色，为氧化酶试验呈阳性；假设不变色，为氧化酶试验阴性。

③绿脓菌素试验：取可疑菌落2"-3个，置于绿脓菌素测定用培养基上，于37C培养24h，参加氯仿，色素溶于其内后，参加盐酸，上层稀盐酸液内出现红色时为阳性，表示菌落中含有绿脓菌素。

④明胶液化试验：将可疑菌落的纯培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，置37C_,培养24h，取出放人冰箱10～30min，如有溶解，即明胶液化试验呈阳性；如凝固不溶，则明胶液化试验呈阴性。

⑤硝酸盐复原试验：挑出被检纯培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，置37℃培养24h，在培养基中的小倒管内有气体者，试验呈阳性，说明该菌能复原硝酸盐并将亚硝酸盐分解产生氢气。

⑥4213生长试验：挑取纯被检物，接种于普通琼脂斜面培养上，于42'C培养48h，绿脓杆菌能生长为阳性反响。

(2)结果报告

被检试样液经增菌、别离培养后，观察菌落，对疑似绿脓杆菌菌落，证实为革兰氏阴性杆菌，且氧化酶、绿脓菌素试验都呈阳性，则报告试样检出绿脓杆菌；假设其中绿脓菌素试验为阴性，但明胶液化试验、硝酸盐复原试验及42C生长试验都为阳性，这时也报告测试物被检出绿脓杆菌。

四、金黄色葡萄球菌的检测1．检测金黄色葡萄球菌的意义

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，因能产生金黄色色素而得名。它为革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界、空气、土壤及水，可在人体皮肤、鼻腔、咽喉等处生存，耐热性强，对于枯燥和紫外光的抵抗力亦较大，为一种致病菌，可通过多种途径侵入机体，导致各种疾病和可引起皮肤或器官的多种化脓性感染(故它又名为化脓性葡萄球菌)，严重时可导致败血症。国内外膏霜类化装品中曾检出此种细菌，因此，在化装品中检测葡萄球菌具有重要的卫生意义，我国化装品卫生标准中规定：在化装品中不得检出葡萄球菌。

2．金黄色葡萄球菌和生化特性

金黄色葡萄球菌菌体呈圆球形，直径0．8～1．0／lm，常成堆排列成葡萄状，有时可单个、成双或成短链；它为需氧或兼性厌氧类细菌，在普通营养培养基上即可生长繁殖；能在高浓度的食盐(7％一9％)中生长繁殖，能耐高达15％的食盐。利用此特性可与其他菌别离鉴别；它在生长繁殖过程中，在培养基上可代谢产生金黄色脂溶性色素，但也有变异菌

株产生浅黄或白色色素；它能分解多种糖类，能分解甘露醇，产酸；还可液化明胶；它的另一个特性是能产生溶血素，可使血液培养基的红细胞溶解，在菌落周围产生溶血圈；金黄色葡萄球菌还能产生血浆凝固酶，能使抗凝的兔或人的血浆发生凝固，其试验方法有两种：玻片法和试管法，葡萄球菌所产生的血浆凝固酶有两种：一种为结合凝固酶，它是结合在细菌的细胞壁上，直接作用于血浆中的纤维蛋白，使细菌凝成块状，玻片法试验的阳性结果是由此酶形成；另一种是在菌体内产生释放到菌体外，称为游离血浆凝固酶，它能使血浆中的凝血酶原变为凝血酶类产物，试管法的阳性结果是由此酶形成的。

3．检验操作及结果报告

(1)检验操作步骤

增菌培养：取1:10稀释的样品10mL接种到90mLSCDLP液体培养基中，置37'C培养24h，进展增菌培养。也可在含7．5％的氯化钠肉汤培养基中进展增菌培养。

别离培养：从前增菌培养液中，取l～2接种环，划线接种到Baird-Pairker氏培养基或血琼脂平板上，置3712培养24～48h。BairdPairker琼脂培养基中的氯化锂可抑制革兰氏阴性菌生长，丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长；卵黄亚碲酸钾增菌剂中氯化钠用量大，可抑制*些细菌的生长，而卵黄中的卵磷脂有促进金黄色葡萄球菌生长和鉴别的作用。

观察培养基所形成的菌落，血琼脂培养基的葡萄球菌菌落颜色鲜明，茵落较大(1～2mm)，有溶血反响，菌落周围产生溶血圈，容易检出。

证实试验：

①染色镜检：取可疑金黄色葡萄球菌菌落，进展革兰氏染色、镜检试验。

②甘露醇发酵试验：取可疑菌落接种到甘露醇发酵培养基中，置37℃培养24h，金黄色葡萄球菌能分解甘露醇，使培养基产酸。

③血浆凝固酶试验：分别进展玻片法和试管法试验，将待检菌落与滴加在玻片上的血浆和生理盐水研磨，5min内，血浆凝成块状或颗粒状，而盐水玻片上无凝固现象，这时玻片试验为阳性；试管法试验，需经24h培养，血浆凝固时为阳性。；

(2)结果报告

被检试样液经增菌、别离培养后，观察菌落疑似金黄色葡萄球菌，证实与革兰氏阳性葡萄球菌，并甘露醇发酵试验及血浆凝固酶试验均为阳性，即报告检出金黄色葡萄球菌。

在检验金黄色葡萄球菌时，血浆凝固酶试验为主要指标。故假设疑似菌落革兰氏阳性，不发酵甘露醇(甘露醇发酵试验阴性)，但血浆凝固酶试验阳性，这时也可断定检出金黄色葡萄球菌。

对疑似菌落，其革兰氏阳性，假设甘露醇试验阴性，有血浆凝固酶试验阴性，这时可断定为未检出金黄色葡萄球菌。

五、霉菌酵母菌的检测1．化装品中检测霉菌酵母菌的意义

霉菌在自然界分布极广，土壤，水域、空气、动植物体内外都可生长霉菌，霉菌同人类的生产、生活有着密切的关系，它在食品、医药、农业等部门得到了广泛应用，但霉菌对人类的危害愈来愈引起人们的重视。

化装品的基质所富有的营养成分及酸碱度、温度等都适宜霉菌在化装品中生长繁殖，化装品的生产环境、生产设备、生产过程及产品都易受到霉菌的污染，据对局部化装品的质量卫生检查说明，霉菌对化装品的污染是相当严重的，霉菌的污染所引起的化装品霉变，是化装品变质的一个主要原因。因此，在化装品中霉菌的检测是很重要的，目前，对于化装品中

霉菌的检测，我国尚未制定统一标准，现仅介绍在化装品中检测霉菌酵母菌总数的方法。酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌，在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在时，酵母菌生长较快。在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和二氧化碳。因酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。2．化装品中的霉菌酵母菌与培养基

(1)与化装品关系密切的霉菌

"霉菌〞不是微生物分类学上的名称，而是"丝状真菌〞的统称，真菌属真核微生物。霉菌菌体是内分枝或不分枝的菌丝组成，霉菌的繁殖能力一般都很强，而且方式多样，包含了有性繁殖和无性繁殖。霉菌的形态各异，即使同种霉菌在不同条件下培养其形态也有差异，因此，各种霉菌具有其标准的培养基，如青霉和曲霉标准培养基是察氏培养基，酵母菌是麦芽汁，常以在这些培养基上形成的菌落来鉴定霉菌的种类。霉菌可产生多种毒素，如黄曲霉菌产生的黄曲霉素可引起实验动物：致癌。与化装品关系密切的霉菌有以下几种：

毛霉：它是一种较低等的真菌，多为腐生、寄生，具有分解蛋白质的能力，经培养基培养其菌落为白色到灰褐色，絮状蔓延生长迅速，菌丝粗不别离，毛霉分布于土壤、淀粉性食品、化装品上，引起腐霉变质。

曲霉：它是具有发酵作用的重要菌种，它能产生对人体有害的曲霉素，引起曲霉病，可侵犯机体多种部位如皮肤、鼻、眼、耳、气管、肺等，形成炎性肉芽肿。经培养基培养其菌落局限像小纽扣、丝绒状、絮状，黄色、橙色、黄绿色等。曲霉广泛分布于土