DB15T 2906-2023 牛副流感病毒3型检测技术规范

发布发布内蒙古自治区市场监督管理局2023-04-102023-03-10ICS11.220CCSICS11.220CCSB41内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准DB15/T2906—2023牛副流感病毒3型检测技术规范Technicalspecificationfordiagnosticofbovineparainfluenzavirustype3DB15/T2906—2023DB15/T2906—2023II前 言本文按GB/T1.1—2020《准工导则 第部分标化件结和起规》起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。DB15/T2906—2023DB15/T2906—2023DB15/T2906—2023DB15/T2906—202311病毒分离5 流行病学临床症状（41℃）4 牛副感毒3型 bovineparainfluenzavirustype3,BPIV3属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒（见附录A中图A.1）。下列术语和定义适用于本文件。牛副流感病毒3型检测技术规范范围本文件规定了牛副流感3型的临床诊断、病原分离鉴定、RT-PCR、ELISA等诊断技术要求。本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对牛副流感病毒3型的检测。（GB/T6682 NY/T541 牛肾细胞系（MDBK细胞系）、棉签、马血清（HBS）、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养板。仪器电子天平、研磨仪、台式冷冻离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱。鼻拭子3mL～5含1000IU/mL1000μg/mLDMEM培养基的冻存管中，编号，记录，于2℃～8℃条件下保存并尽快送往实验室。血清2mL～52℃～8℃条件下保肺组织疑似因BPIV3感染死亡的牛，按照NY/T541的规定采集肺组织样品，放入离心管，编号，记录，于2℃～8℃条件下保存并尽快送往实验室。拭子将鼻拭子样品液冻融两次，然后以6000r/min离心10min，再使用一次性注射器吸取上清经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。血清将静置分层的血清转移到灭菌离心管，-20℃以下保存备用。肺组织取体积大小为2×2×3cm肺组织样品，按照体积比为1:3～1:5的比例加入含有双抗的PBS（pH7.2～7.4），研磨成匀浆液，冻融两次，再以6000r/min离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃下保存备用。80%的24孔板MDBK200μL，375%CO2min3.5%HBS1mL37℃，5%CO23d～5d3～5代。细胞大量脱落、贴壁细胞变长聚集形成网状（见附录A.2），当70%～80%细胞出现病变时收获培养物，经反复冻融，以3000r/min离心10min，取上清进行5.2的检测。RT-PCR233Inhibitor(40U/μL)0.5μL(20U)，PrimeScriptIIRTase(200U/μL)1μL，RNaseFreedH2O4.5μL，缓慢混匀。反应条件为42℃45min，95℃5min后，冰上冷却。PCRPremix溶液12.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，RNaseFreedH2O9.5μL。95℃预变性5min,95℃30s，55℃30s，72℃60s，进行35个循环，72℃延伸10min。PCR取PCR产物101.510030506bp506bp扩增带为牛副流感病毒3型阳性，否则为阴性（见附录A中图A.2）。间接ELISA抗体检测5.3.1 移液器、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、阳性质粒（阳性对照）、灭菌超纯水（阴性对照）、引物。仪器PCR仪、台式冷冻离心机、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。处理的样品或细胞培养物。RNARNART-PCRRT引物BPIV3-F/BPIV3-R按照附录A.3进行引物序列合成并用无菌的DEPC处理水配制成10μmol/L。20μL1μL，dNTPMixture1μLRNA2μL，RNaseFreedH2O6μL65℃保温5minMicrotube管加5×PrimeScriptIIBuffer4μL，RNase4BPIV35.15.2BPIV33型感染。临床无明显特异症状的非免疫动物经5.3检测出抗体阳性，判为牛副流感病毒3型感染。46 阴、阳性血清及稀释液对照各2孔。加样完毕后封板，放37℃孵育1h，洗涤三次。每孔加入用封闭液稀释至工作浓度的酶标记抗体100μL，置37℃再孵育1h，洗涤三次。加入显色底物（TMB）溶液100μL/孔，置37℃避光反应15min。加入终止液50μL/孔,混匀后即刻测量OD450值。5.3.4 P/N法被样品(P)吸光值阴对样(N)值比。P/N≤1.50 判阴性2.0＞P/N1.50 P/N2.0 3NIgGGB/T6682仪器水浴锅、温箱、洗板机、微量振荡器、酶标仪、移液器。BPIV3重组N蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.05μg/mL包被反应板，每孔100μL，4℃包被16h。洗板甩掉孔内的包被液，洗涤液洗涤三次，200μL/孔。封闭每孔加封闭液，200μL/孔，置37℃封闭1h,洗涤三次。加样阴、阳性血清和被检血清均用封闭液作200倍稀释，每个样品两个平行，每孔100μL，每块板均设附录A（）3（BovineparainfLuenzavirustype3BPIV33BPIV3BPIV3BPIV3细胞病变示意图见图A.1。注：图A：正常MDBK细胞对照图；图B：BPIV3感染MDBK细胞病变图。图A.1BPIV3PCRPCRPCR引物序列见表A.1.表A.1PCR引物序列(5’-3’)位置目的片段参考毒株上游引物CTGGAGTTATGCGATGGGTGT993-1498506bpEU277658.1（Q5592）下游引物TGTCGTTTGCGATGTTGGTT上下游引物用无菌的DEPC处理水配制成10µmol/L。BPIV3NCTCAAGGCATTAATGGAATTGTATTTGTCAAAAGGGCCACGTGCACCTTTCATATGCATTTTGAGGGATCCTGTACACGGTGAATTTGCACCGGGAAATTACCCTGCTCTCTGGAGTTATGCTATGGGTGTAGCAGTTGTACAGAACAAGGCCATGCAACAGTATGTGACAGGACGATCTTATCTAGACATTGAAATGTTCCAACTTGGTCAGGCAGTAGCACGGGATGCTGAATCACAGATGAGCTCAATACTAGAGGATGAACTAGGGATAACACAGGAAGCCAAACAGAGCTTGAAGAATCACATGAAAAGGATCAGTAGTTCAGATACAGCCTTCCAAAAACCAACAG566GAGGAGCAGCCATAGAGATGGCAATAGATGAAGAAGTAGAGCAGCTTGATTCCAAAGGGGATCAAGACCAAAGCAACGGAAATCAGTCATCCATGATCCCCTATGCATGGGCAGATGAAACCAACAATAGCAATCAAACTGAACCAACAACAGA电泳结果见图A.2。注：M：DL2000；1：阳性对照；2：阴性对照。图A.2PCR77B.4 终止液111mL分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889mL去离子水中，分装保存备用。20