一株新型饲料用酶菌株的筛选及发酵条件研究

一株新型料用酶菌株筛选及发酵条研究植酸酶phytase)也称肌醇六磷酸酶(myo-inositol-hexaphoshatephosphohydrotase)它是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷（或者磷酸盐）一类酶的总称…，分为两类，一是一植酶EC3.1.3.8)，二是6一植酸酶(EC3.1.2.6)，是一种型、绿色环保的饲料用酶。由于动物的消化道不能吸收植酶，大量未被利用的植酸磷排入环境，造成水域的富营化污染。植酸酶可释放植酸中的磷，提高动物对磷的吸收用率，减少排泄物中有机磷的含量。目前，对酸性植酸酶究较多，它仅适用于单胃动物畜禽和少数鱼（如虹鳟等但适于消化道为中性的鲤科鱼类，因此对中性植酸酶缺较深入的研究。鉴于此，我们从土壤中筛选出产中性植酸的高产菌株，对其菌株的培养和分泌中性植酸酶的条件进了初步研究，为扩大中性植酸酶在饲料工业中的应用提供论依据。11.1

材料与方法材料与试剂植酸酶菌株分离样品样品为将采集于威海郊区玉米地肥沃土壤中的植酸酶珠与麸皮、发芽小麦混匀并放置20余天后的混合物。

试剂：植酸钠p-0109（Sigma司），植酸钙（湖北三鑫生物工程有限公），其他试剂均为国产分析纯。细菌营养肉汁平板培养基蛋白胨牛肉膏3g/L、NaC15g/L、琼脂15--207.0。植酸钙筛选平板培养：葡萄糖20g/LCaC122g/L、NHaN035g/L、KC10.5g/LMgS04"7H200.05g/LFe-S04"7H200.01g/LMnS04"H200．叭植酸钙、琼脂15g/L，pH7.0。产酶培养基：可溶性粉40g/L胰蛋白胨、NAN028.6g/L、NHaN035.0g/LK2HP040.10g/LKC10.10g/L、gC120.10g/L、MnC120.09g/L,pH1.2方法产中性植酸酶菌株的选：将土壤样品稀释后均匀涂布到筛选的培养基培养3--4d后将产生透明圈的菌株接种于营养肉汁平板培养基划线分离；挑选单菌落接种于筛选的培养基培养3--4d后测量直径（径比=透明圈直径／菌落直径）；选择直径大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基保存。挑取上述初筛菌株接于细菌营养肉汁培养基，30℃、120--150r/min摇振养24h，按10%接种量接种于100mL的产酶培养基，、150r/min振培养5d，每24h取5mL培养液，3000r/min离心去菌体，上清液利用截留分子量

为的透析袋去离子水中透析3--4h到去除无机磷的酶液用于酶活性定，根据酶活力大小对菌株进行复筛。培养条件对产酶的影：分别采用不同的发酵温度、接种量、培养基初始pH和液量，经培养后测定发酵液酶活，找出最佳培养条件；改培养基碳氮组成，以找出最佳碳氮源。酶活测定方法：采用酸亚铁一钼蓝法测定酶活l。酶活性单位U)定义：在一定条件下，每分钟释放出1nmol无机磷所需的酶量一个酶活性单位用U示单位为nmol/min。2果与分析

菌株筛选土样经过筛培养基涂布、富集培养、多次划线分、点种筛选，共初筛出21株植酸酶产生菌。然后，再筛出其中透明圈与菌落直径比值较大的10（以phy代表酸酶菌株），在30℃、150r/min振下分别进行发酵培养测定其发酵液酶活力大小。结果见表l由表1可见所筛选出的个株的透明圈与菌落直径比均在1.9--2.5间，得到酶活大于100IU/mL的菌株有2株，即菌株phy7和phylOphyl0经16SrDNA序列测定与分析，得到该菌属假单胞菌属(Pseudomonas)，且从系统发育树得出该菌归绿脓假单胞菌．2.2中性植酸酶产酶酵条件

以实验菌株行产酶条件研究。培养基起始pH对产的影响：配制不同起始pH值4.0—的液体发酵培基，30℃150r/min、10%的接种量振荡培养h后测其发酵液酶活结果见图1从图可见pH为4.0--5.0时产酶增长最快pH为产酶量最多pH为6.0之后时酶量迅速下降因此确定最佳培养基起始pH为5.0发酵温度对产酶的影在℃发酵温度下150r/min振荡培养24h测定其发酵液酶活，结果见图2。图2表明发酵温度为30时产酶量最高酵温度为25℃和35℃时酶活都有所下，发酵温度为20℃40℃时产酶量最低，因此最佳发酵温为。接种量对产酶的影响将种子液按3%、7%、11%的比例接入装有mL培养基的250mL三角瓶后30℃、150r/min振荡培养24h，定其发酵液酶活，结果见图。图表，按7%的种量产酶量最大；接种量右时，菌体生长慢，产酶量。随着接种量的增加，产酶量相应增加，到接种量为7%后随着接种量不断增大，产酶量有所下降，因此接种量为7%左时较适宜。装液量对产酶的影响250mL形瓶中分别加入40.OmL、60.、、120.、140.OmL优化的液体培养基，上述优化的产酶条件下以150r/min

振荡培养24h测定酵液酶活力，结果见图4。由图4可见，随着发酵液体积增加产酶量增加，但高于OmL后产酶量反而下降，可与其产酶时需充足的氧气供应有关；装液量在80.OmL时酶量最大，达到226.25U/mL。正交试验：根据单因试验结果，设计接种量、装液(B)和起始pH因素三水平正交试验，结果见表2。表2表明，装液量的R值最大，说明它对产酶的影响大，为主要因素。起始pH的R值小，说明它对产酶的影响小，为次要因素种因对中性植酸酶产酶量影响顺序依次为：装液量接种量起始pH直观分析得出最佳水平组合应为A283，而该组合在交试验中并未出现；利用组合A2B3C2验证试验结果，重次酶平均值均大于表2中任一处理的结果，因此最佳养基条件为30℃、100mL的装液量、7%的接种量、起始pH为6。2.3碳氮源对产酶量影响不同碳源对产酶的影以质量分数为4%的麦芽糖壳聚糖、蔗糖、葡萄糖可溶性淀粉、麸皮分别代替产酶培养基中的碳源，在30℃150r/min振发酵培养24h，测定其发酵液酶活，结果见5。图5表明，可溶性淀粉作为碳源，酶活最高，可达183U/mL，他几种影响差异不大。不同氮源对产酶的影：以酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸出、尿素、(NH4)2S04-7H20、NHaN0

3、NAN02分别代替产培养基中的氮源，以0.5%的中的含氮量为标准来加其他氮源，在30℃、振荡发酵培养24h，测其发酵液酶活，结果见图6。从图6可见，用NaN02作为源，酶活最高，活力单位可达218.6u/mL酶液；胰蛋白胨NHaN03效也较好，其他氮源酶活略低，较好的几个氮顺序为NAN02>胰蛋白胨>NH4N03>牛肉膏。3结论从天然土壤中筛选出20株产中性植酸酶活性的菌株，对一株产中性植酸酶性较高的绿脓假单胞菌(Phyl0)进行了培养条件的优化。酶在初始、发酵温度、装液量100.0mL、接量7.0mL碳氮源分