细胞融合与体细胞杂交演示文稿

细胞融合与体细胞杂交演示文稿当前1页，总共83页。细胞融合与体细胞杂交当前2页，总共83页。孕育新生命的太空“婚礼”一场筹备了10年之久的两对“细胞太空婚礼”将在“神舟4号”飞船上举行。植物细胞电融合实验采用的是有液泡的黄花烟草原

生质体和脱液泡的“革新一号”烟草原生质体。动物细胞电融合实验采用纯化的乙肝疫苗病毒表面抗原免疫的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞。在微重力条件下，细胞在融合液中的重力沉降现象将消失，更有利于细胞间进行配对与融合。细胞电融合实验不仅可以培育出地球上植物的新品种，还能为科研人员培养出特定的动物细胞，为药厂提供大量所需的单克隆抗体。当前3页，总共83页。

一道选择题我国2002年12月30日发射的“神舟4号”飞船顺利返回

在飞船上进行了空间动物细胞融合实验,该实验所依)

据的原理和促进细胞融合的方法分别是(

A、细胞的全能性；灭活病毒诱导融合

B、细胞的全能性；电刺激融合

C、细胞膜的流动性；灭活病毒诱导融合

D、细胞膜的流动性；电刺激融合当前4页，总共83页。神舟六号-空间细胞搭载体系进行了心肌细胞和成骨细胞原代培养及地面模拟试验；考察在飞船入轨前与入轨后不同重力条件下细胞样品的状态与变化。利用“神舟”6号飞船舱内环境，在有人参与的条件下进行空间细胞学实验。当前5页，总共83页。酸酸甜甜才是生活！当前6页，总共83页。PartI:细胞拆分与重组概述1、细胞拆分技术的发展概况1952年Briggs

和King首创了核移植的方法1967年Careter发现细胞松驰素B能诱发体外培养的小鼠成纤维细胞的排核作用1972年Prescott等首先应用离心结合CB分离哺乳类细胞的胞质体获得成功细胞核、质分离技术与细胞融合技术汇合起来，建立了细胞重组技术当前7页，总共83页。胞质体（cytoplast）：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞，由细胞松弛素B处理后，经离心得到。核体（karyoplast）：由胞质体分离出来的核，带有少量胞质并围有质膜的结构。胞质杂种细胞：将胞质体和另一完整细胞融合得到的细胞。核体杂种细胞：核体与另一完整细胞融合。重组细胞：核体与另一种细胞的胞质体融合。当前8页，总共83页。1、2、3亲本细胞4、6核体5、7胞质体8、9杂种细胞10重组细胞11胞质杂种细胞ⅠPEG介导Ⅱ筛选当前9页，总共83页。2、细胞拆合与重组的概念（1）细胞拆合:把完整细胞的细胞质和细胞核用特殊的方法 分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来， 或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把 同种或异种的细胞核和细胞质重新组织起来， 培育新的细胞或新的生物个体当前10页，总共83页。（2）细胞重组（cellreconstruction)将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介子的诱导下，使胞质体与完整细胞合并，或胞质体与核体重新组成，构成细胞的过程当前11页，总共83页。3、细胞拆合的方法（1）物理拆合法用紫外线或激光将核破坏，再用微玻璃针或微吸管将其他细胞核注入（最早使用）将细胞融合技术与显微外科手术结合，作微吸管 将细胞核连同周围少量细胞质吸出，再注入已去 核的细胞中当前12页，总共83页。显微操作法进行细胞核移植当前13页，总共83页。（2）化学拆合法☆细胞松驰素B

（CytochalasinB）结合高速离心☆CB阻断细胞质分裂，不干扰核分裂；引起细胞表面形状的改变和排出细胞核。机理：CB是真菌的一种代谢产物，可以切断微丝，并结合在微丝末端阻抑肌动蛋白聚合，但对解聚没有明显影响，因而可以破坏微丝的三维网络！当前14页，总共83页。第二部分细胞融合当前15页，总共83页。几个关键问题亲本的来源融合方法融合细胞的筛选融合细胞的克隆融合细胞的鉴定当前16页，总共83页。杂交1.通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体的方法。2.两条单链DNA或RNA的碱基配对。杂交优势：两个遗传基础不同的植物或动物进行杂交，其杂交后代所表现出的各种性状均优于杂交双亲，比如抗逆性强、早熟高产、品质优良等。一般情况下，通过生殖细胞相互融合而达到这一目的过程称为杂交。较多的是种间、种内杂交。由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞杂交。当前17页，总共83页。几种细胞融合成功的例子融合生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间叶——叶甘蓝——青菜叶——根大豆——马唐草愈伤组织——叶矮牵牛——龙面花叶——花瓣大麦——花生种子——种子大麦——大豆叶——悬浮细胞小麦——矮牵牛叶——花瓣玉米——大豆叶——悬浮细胞大豆——野碗豆悬浮细胞——悬浮细胞大麦——蚕豆叶——根大豆——草香木犀悬浮细胞——叶酵母菌——鸡原生质体——血红细胞大豆——烟草悬浮细胞——叶人——胡萝卜腹水癌细胞——原生质体番茄——马铃薯叶——根尖人——小鼠纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞

1972 1972 1972 19731974 1974 1974 1974 1974 1975 1976 1976 1976 1976 1978 1978当前18页，总共83页。番茄+马铃薯当前19页，总共83页。问题：有没有可能培育出地下结土豆，地上结番茄的超级植物？1978年德国科学家梅歇尔斯将番茄与马铃薯进行体细胞杂交育成薯番茄“泡马豆”（po(tato)-(to)mato）。马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达40％～50％。当前20页，总共83页。1978年德国科学家梅歇尔 斯等人把马铃薯(potato)和 番茄(tomato)的原生质体 融合获得了体细胞杂种

“泡马豆”（pomato)

培育出的“泡马豆”外型倾向于蕃茄，花叶果实具有杂种特点，遗憾的是地下部分没有长出科学家们想象中的大土豆。TomatoesontheTopandPotatoesUnderground当前21页，总共83页。视频：植物体细胞杂交当前22页，总共83页。部分野生品种的块茎、果实虽不能食用，但它们的植株具有较强的抗病虫害、抗盐碱性和耐寒能力。因此，用野生马铃薯和番茄分别与马铃薯、番茄作物杂交，培育出了生 存能力较强的杂交系植物。杂交玉米等杂交植物比它们的亲本 更为健壮，产量更高。杂交拟南芥（中间）比其亲 本（左和右）要大《自然》（Nature）2008年11月23日：中美科学家近日研究发现杂交植物比其亲本生长更大更好的原因：负责光合作用和淀粉代谢的基因更为活跃。当前23页，总共83页。骡子：雄驴和雌马交配所产的杂种叫驴骡。雌驴和雄马交配所产的杂种叫马骡。狼狗：狗与狼的杂交后代。杂交斑马：由斑马和马科动物杂交产物狮虎：狮子和老虎的杂交产物。豹狮：美洲豹与狮子的后代。当前24页，总共83页。不亲和性不亲和性：在有性生殖过程中，由于生物个体的细胞或组织水平上的不协调而使受精或接合不能正常进行，或是受精后不能产生后代的现象。例如：生殖细胞不能融合，或受精卵不能发育，或子代无繁殖能力等。是双亲个体间基因型的不协调或是染色体组非同源性在生殖生理表型上的一种反映。不亲和性是稳定物种的重要机理之一。种间不亲和性：异种、异属生物个体之间的生殖不亲和现象常由染色体组的不同所造成。一般地说，越是远缘则不亲和性越高，直到完全不能受精。种内不亲和性：种内个体间的不亲和现象往往是受不亲和基因所制约而并不是染色体组不同的结果。当前25页，总共83页。远源杂交远缘杂交：不同种属之间，或是地理上远缘的种内亚种之间个体的交配称为远缘杂交。由于种属间存在着种种隔离机制，致使远缘杂交常表现不亲和或获得的远缘杂种表现不育。体细胞杂交是解决远源杂交不亲和性的有力手段之一，更好地利用自然界基因资源，培育新物种。当前26页，总共83页。本节主要内容：1细胞融合2细胞杂交及其在育种中的应用关键问题：细胞融合的原理、方法与关键环节当前27页，总共83页。一定义与意义细胞融合（Cellfusion）是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。对于植物也叫“原生质体融合”。亲本细胞是体细胞，也叫“体细胞杂交（somaticcellhybridization）”。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术在创造新细胞、培育新品种方面意义重大。当前28页，总共83页。二细胞融合的分类1.材料：原生质体（去除了细胞壁的裸露的细胞）、动物细胞2.从亲本来源：（1）同核体（Homokaryon）：基因型相同的细胞融合成的融合细胞称为。（2）异核体（Heterokaryon）：来自不同基因型的融合细胞。3.从融合效果：（1）对称融合（Symmetricfusion）：两个完整的细胞间的融合。（2）不对称融合（Asymmetricfusion）：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再与另外一个完整细胞进行融合当前29页，总共83页。当前30页，总共83页。三发展历史自发融合现象最初在动物细胞中发现。1838年发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。动物体内的破骨细胞也是自发融合形成的多核细胞。1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。20世纪70年代初，华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇(PEG)能促使植物原生质体融合，开拓了植物细胞融合的研究。20世纪80年代，齐默曼（Zimmerman）等建立电场诱导细胞融合方法。当前31页，总共83页。

四细胞融合原理1细胞膜的结构与功能细胞膜磷脂分子扰动出现通道——细胞桥当前32页，总共83页。主要环节（1）亲本选择（单细胞或原生质体制备）（2）两原生质体或细胞互相靠近，粘附（3）质膜融合形成细胞桥P133图7.4（4）胞质渗透（5）细胞核融合（6）融合细胞筛选当前33页，总共83页。原生质体及其制备（1）定义：去除细胞壁后裸露的细胞称之为原生质体（protoplast）。（2）特点：无细胞壁，可以方便地进行遗传操作、人工诱变、细胞器转移、细胞融合等操作。具有全能性，能再生细胞壁。当前34页，总共83页。（3）制备与纯化酶解法的建立1960年，英国科金第一次采用酶方法从番茄幼苗大量制备出原生质体。使植物细胞融合技术得以建立。植物细胞的细胞壁主要成分是纤维素（纤维素微纤丝Cellulosemicrofibrils）、果胶（pectin）、多糖（glycan）。果胶酶、纤维素酶等处理植物组织，可以破坏胞间层和去掉细胞的纤维素外壁，得到游离的裸露原生质体。当前35页，总共83页。4分离分离方法飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll等。离心法：低速离心，收集沉淀。结合法：先低速离心，再漂浮Percoll分层液:是经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。

当前36页，总共83页。关键：细胞核的融合若是没发生细胞核的融合，仅发生了细胞质的融合，则可能成为嵌合细胞。含有多个核的异核细胞合并后形成的单核细胞称为合核细胞。细胞核的合并发生在有丝分裂过程中。但是这种有丝分裂只有当两个核的DNA合成基本同步时才能发生：两个核同时进行有丝分裂，形成一个纺锤体，全部染色体都排列在一个赤道板上，结果伴随着细胞分裂就形成了单核的子细胞，其细胞核中含有双亲细胞的染色体。当前37页，总共83页。五细胞融合方法1.生物法病毒诱导细胞融合：研究最早的细胞融合诱导方法。主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳上的某些糖蛋白有促进细胞融合的功能。仙台病毒、疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙台病毒（HAJ）是两层磷脂组成的外膜包裹着RNA与蛋白质的复合体。因HAJ病毒毒力弱，易被灭活而常采用。缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，而且一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用病毒诱导法进行细胞融合。当前38页，总共83页。原理与过程（1）足够量的病毒颗粒附着在细胞膜上起搭桥作用，使细胞聚集在一起。（2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相融合。粘结部位质膜被破坏，不同细胞间形成通道，细胞质流通并融合（病毒也随之进入细胞质）。（3）有丝分裂，细胞核融合，形成杂种细胞。当前39页，总共83页。2化学法可以采用的化学诱导剂包括：NaNO3、高pH的高浓度Ca2+离子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明胶、抗体、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。细胞膜电荷平衡被打破。当前40页，总共83页。（1）NaNO3诱导融合1909年，凯斯特（Kuster）发现机械分离的发生了质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体在NaNO3溶液中可以恢复并伴随着细胞融合。1972年，卡尔森（Carlson）利用NaNO3诱导融合了粉兰烟草和郎氏烟草原生质体，培育出世界第一株体细胞杂种。NaNO3的钠离子可以中和原生质体表面负电荷，引起原生质体聚集，促进细胞融合。NaNO3对原生质体无损害，但融合效率低，一般小于4%。当前41页，总共83页。（2）高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合1973年，凯勒（Keller）和梅尔切斯（Melchers）发现采用强碱性（例如pH10.5）的高浓度钙离子溶液（50mmol/LCaCl2•2H2O）在37℃下处理两个品系的烟草叶肉原生质体，很容易促使融合，融合率可以达到10%。钙离子中和原生质体膜或细胞膜表面电荷，使彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高pH能改变质膜的表面电荷，利于细胞融合。当前42页，总共83页。（3）PEG诱导聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在200－20,000之间，分子量1,000以下者为液体，1,000以上者为固体。PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。当前43页，总共83页。（4）高Ca2+和pH结合PEG诱导在高Ca2+和pH溶液的作用下，将与质膜结合的PEG分子洗脱，将进一步加剧电荷平衡失调，从而提高融合的几率。因此，PEG结合高pH的高浓度Ca2+离子诱导融合方法成为一种较常用的细胞融合方法。优点：基于PEG的诱导融合优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点：是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。当前44页，总共83页。

细胞融合例子1甘蓝与大白菜的化学诱导融合当前45页，总共83页。当前46页，总共83页。当前47页，总共83页。当前48页，总共83页。当前49页，总共83页。实验方法举例正交实验法:

正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。正交实验设计包括两部分内容：第一，是怎样安排实验；第二，是怎样分析实验结果。响应面分析法:

是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件．当前50页，总共83页。3物理法电融合诱导法（Electrofusion）：利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合的技术。原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。优点：融合率高、重复性与可控制性强。缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。当前51页，总共83页。当前52页，总共83页。棉花细胞电融合

BLS细胞融合仪（1）聚集：在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子，彼此靠近，定向排列成串球状。（2）细胞膜融合：在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。（3）异核体：膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融合。（4）融合细胞：细胞核融合。当前53页，总共83页。

细胞融合举例2——薄荷的电诱导融合亲本：E33、E47两个薄荷亲本原生质体（5-9×105），0.7M山梨醇。仪器：Eppendorf电转仪、融合杯（-250微升，-50微升）观察：DAPI染色：4，6-联脒-2-苯基吲哚是一种常用的荧光染料，与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长正好是356nm。染色标记细胞核的位置。参数：电压：1.5-3V，超过2V破裂，选1.5V。脉冲电压：0-300V。脉冲时间：30-60S，每次增加10S，40S最佳。当前54页，总共83页。融合率达到16-27%，原生质体存活率97%当前55页，总共83页。融合细胞的筛选因融合的随机性而成为细胞融合的关键而必需的技术当前56页，总共83页。1筛选的原因与必要性细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。问题：A与B融合过程中，你能预见有哪些形式的细胞吗？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B，A-A-B，B-B-A等多聚体。未融合的A，B。当前57页，总共83页。2杂种细胞筛选方法（1）细胞形态大小差异（2）选择性培养基筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞的方法。例如：利用抗性标记、酶缺陷型、激素需求差异等。亲本原生质体生长要求外源激素，而有的杂种细胞由于双亲互补作用会产生内激素，从而使杂种细胞能在无激