怎样降低糖基化产物

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糖基化终产物对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素3基因表达的影响

糖基化终产物对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素3基因表达的影响目的：研究糖基化终产物（AGEs）对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素3(galectin3)表达的影响。方法：将培养的人肾小球系膜细胞(HRMC)用不同浓度(50、100、200及400mg・L-1)的AGEs干预24h或同一浓度(200mg・L-1)的AGEs干预0、24、48及72h，以无血清培养基(DMEM)和相应浓度的牛血清白蛋白（BSA）为对照。用RTPCR检测细胞中半乳糖凝集素3的mRNA水平。结果：不同浓度AGEs组HRMC的半乳糖凝集素3mRNA水平与对照组相比均有显著差异（P＜0.01），且随着AGEs浓度的增高，半乳糖凝集素3mRNA水平也逐步增高(P＜0.05)；

AGEs干预HRMC24、48、72h，半乳糖凝集素3mRNA水平与对照组相比有显著差异（P＜0.05），且随着干预时间的延长，半乳糖凝集素3mRNA水平也逐步增高(P＜0.01)。

结论：AGEs以时间及剂量凭借的方式促进HRMC半乳糖凝集素3mRNA的表达。

［摘要］糖基化终产物；

人肾小球系膜细胞；

糖尿病肾病；

半乳糖凝集素3；

基因表达Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofadvancedglycationendproducts(AGEs)ontheexpressionofgalectin3inculturedhumanrenalmesangialcells(HRMC).MethodsTheAGEsBSAwaspreparedbyincubatingbovineserumalbumin(BSA)withglucose.TheculturedHRMCwereintervenedwiththesameconcentrationofBSAandAGEsBSA(50,100,200,400mg・L-1)for24hor200mg・L-1AGEsBSAfor0,24,48or72hrespectively.ThemRNAexpressionofgalectin3inHRMCwereanalyzedbyRTPCR.ResultsComparedwiththatincellsincubatedwithDMEMandBSA,thelevelofgalectin3mRNAincellsincubatedwith50,100or200,400mg・L-1AGEsBSArespectivelyfor24h（P＜0.01）orwith200mg・L-1AGEsBSAfor0,24,48or72hrespectively（P＜0.05）increasedsignificantly.Moreover,withtheincreasedconcentrationofAGEsBSA（P＜0.05）ortheexpandedincubatingtime（P＜0.01）,thelevelofgalectin3mRNAincreased.ConclusionTheAGEsBSAcanstimulatetheexpressionofgalectin3inculturedHRMCinaconcentrationandtimedependentmanner.Keywords：advancedglycationendproducts;

humanrenalmesangialcells;

diabeticnephropathy;

galectin3;

geneexpression糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是1、2型糖尿病的慢性微血管并发症之一，是引起终末期肾病的最常见病因［1］。大量研究说明，糖基化终产物（advancedglycationendproducts,AGEs）在DN的发生进展过程中起了重要的作用［2］。AGEs致病的主要机制之一是其可以与细胞外观的AGEs受体相互作用，引发生物学效应。半乳糖凝集素3（galectin3）是AGEs的受体之一［3］，它(AGER3)与p60(AGER1)、p90（AGER2）被认为作为一个分子复合体（AGE受体复合体）起作用。本测验应用体外制备的AGEs对人肾小球系膜细胞（humanrenalmesangialcell，HRMC）举行干预，查看HRMC半乳糖凝集素3基因表达的变更。

1材料和方法1.1材料牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA，AMRESCO产品)；

D葡萄糖(分析纯，重庆北培化学试剂厂产品)；

HRMC株为TSV40及Hras原癌基因转染的永生系，保持了正常HRMC根本的形态学和生物学特性，由阮雄中博士（RenalUnit，RoyalFreeHospital，LONDON，UK）惠赠；

无血清培养基（DMEM）、HEPES为GIBCO公司产品；

小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；

TRIZOL、RTPCR试剂盒（RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesis）、DNAMarkerSM0241（80、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1031bp）、Taq酶均购自Fermentas公司；

半乳糖凝集素3及βactin引物由上海申能博彩生物工程公司合成；

琼脂糖（电泳级）购自MDBio公司。

1.2方法1.2.1AGEsBSA的制备1.2.2HRMC的培养参与DMEM培养液(含10mmol・L-1Hepes、0.37%NaHCO3、100U・L-1青霉素、100U・L-1链霉素及10%灭活小牛血清)，置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中，每天换液1次，3～4d传代1次。

1.2.3分组测验当细胞达成确定数量后将处于对数生长期的HRMC按1×104移入6孔板中，于37℃、5%CO2的培养箱中孵育至细胞次全融合，弃上清，每孔参与2.0ml不含小牛血清的DMEM培养液，孵育24h，使细胞同步于G0期，弃上清。然后分别用50、100、200及400mg・L-1的AGEsBSA和BSA干预24h，以DMEM作为空白对照；

然后选取敏感浓度200mg・L-1的AGEsBSA和BSA分别干预0、24、48、72h，以DMEM作为空白对照。每组设3个复孔。

1.2.4细胞总RNA的提取各组至培养终点后，每孔弃培养液以Trizol法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计测定RNA的A260nm与A280nm比值在1.60～1.80之间，1%的甲醛变性凝胶电泳表明所提RNA的完整性较好(有28S与18S两条电泳带,其吸光度比值等于2.0)。

1.2.5RTPCR检测半乳糖凝集素3mRNA的表达以2μg总RNA为模板逆转录合成cDNA，用特异性引物对逆转录产物举行半定量PCR。以βactin作为内参引物,在25μl同一体系中举行半乳糖凝集素3和βactin共同扩增。所用βactin的引物：上游5′CGCCGCGCTCGTCGTCGACA3′，下游5′GTCACGCACGATTTCCCGCT3′，扩增长度619bp；

半乳糖凝集素3引物：上游5′CACCTGCACCTGGAGTCTAC3′，下游5′GCACTGGTGAGGTCTATGTC3′，扩增长度497bp。

扩增条件:94℃预变性3min；

然后94℃变性45s，61℃退火60s，72℃延迟60s，共26个循环；

结果72℃延迟7min。PCR产物于1.5%琼脂糖电泳80V60min，用GelDocItimagingsystem扫描分析仪扫描凝胶图谱，用Smartview分析软件对RNA条带举行密度扫描分析，得出目的条带与内参照条带的吸光度比值，对比各组半乳糖凝集素3mRNA表达处境。

1.3统计学处理数据以±s表示，SPSS11.5统计软件分析数据，采用onewayANOVA举行显著性检验，差异显著性设定为P＜0.05。2结果2.1不同浓度AGEs干预HRMC后半乳糖凝集素3基因表达处境培养的HRMC在未加干预时有少量的半乳糖凝集素3表达(图1及图2的1)，其与βactin的吸光度比值为0.217±0.014；

50、100、200及400mg・L-1BSA干预后(图1的2、4、6、8)半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值依次为0.342±0.013、0.373±0.017、0.347±0.013及0.370±0.031，与DMEM组相比表达增加（P＜0.01），但表达量不随BSA浓度的增加而增加（P>0.05）；

50、100、200及400mg・L-1AGEsBSA干预后(图1的3、5、7、9)半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值依次为0.643±0.040、0.777±0.031、0.975±0.047及1.170±0.064，与相应浓度的BSA组以及DMEM组相比半乳糖凝集素3的表达显著增加（P＜0.001），且随着AGEs浓度的增加而增高（P＜0.05）。

M.分子质量标记；

1～9泳道依次表示DMEM组、50mg・L-1BSA组、50mg・L-1AGEsBSA组、100mg・L-1BSA组、100mg・L-1AGEsBSA组、200mg・L-1BSA组、200mg・L-1AGEsBSA组、400mg・L-1BSA组、400mg・L-1AGEsBSA组。#与DMEM组相比，P＜0.05;*与DMEM及BSA组相比，P＜0.05图1不同浓度的AGEs对半乳糖凝集素3表达的影响（略）Fig1ThemRNAexpressionofgalectin3andβactininHRMCincubatedwithdifferentconcentrationsofAGEsBSAfor24h2.2200mg・L-1AGEsBSA干预HRMC不同时间半乳糖凝集素3基因表达处境DMEM组细胞培养0、24、48、72h(图2的1、2、5、8)，半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值依次为0.457±0.021、0.480±0.025、0.499±0.034、0.449±0.033，不同时间相比没有差异（P>0.05）；

BSA干预组细胞培养0、24、48、72h(图2的1、3、6、9)，半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值依次为0.457±0.021、0.592±0.031、0.634±0.026、0.601±0.031，不同时间相比没有差异（P>0.05），但与培养一致时间的DMEM组细胞相比，半乳糖凝集素3的表达增加（P＜0.05）；

AGEsBSA组细胞培养0、24、48、72h(图1的1、4、7、10)，半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值分别为0.457±0.021、0.748±0.066、0.945±0.034、1.200±0.052，随着培养时间的延长，半乳糖凝集素3的表达逐步增加（P＜0.01），且比相应时间的BSA组及DMEM组表达均高（P＜0.05）。

M.分子质量标记；

1～10泳道依次表示DMEM干预0h、DMEM干预24h、200mg・L-1BSA干预24h、200mg・L-1AGEsBSA干预24h、DMEM干预48h、200mg・L-1BSA干预48h、200mg・L-1AGEsBSA干预48h、DMEM干预72h、200mg・L-1BSA干预72h、200mg・L-1AGEsBSA干预72h。

#与DEME组相比，P＜0.05;*与DMEM及BSA组相比，P＜0.05图2不同干预时间的AGEs对半乳糖凝集素3表达的影响（略）Fig2ThemRNAexpressionofgalectin3andβactininHRMCincubatedwithAGEsBSA（200mg・L-1）fordifferenttime3议论DN是糖尿病的严重并发症，其发病机制分外繁杂，目前尚未明确。大量资料证明，长期慢性高血糖与DN的发生有关，虽然高血糖导致DN的机制并不完全领会，但蛋白质非酶糖基化形成的产物AGEs与其受体的相互作用在DN的发生进展过程中起关键作用。

半乳糖凝集素3是半乳糖凝集素家族的一员，它可以通过碳水化合物结合域与细胞外观及基质糖蛋白的β半乳糖苷残基相互作用，并可以通过N段区域形成肽肽结合。这些布局特性使半乳糖凝集素3具有调理细胞粘附、调控细胞周期、mRNA剪切功能、与晚期糖基化终产物高亲和力结合等多种功能。已有研究说明，半乳糖凝集素3在糖尿病的慢性并发症的靶组织中均有表达［58］，它可能参与了糖尿病慢性并发症的发生进展。本研究通过查看AGEs对HRMC半乳糖凝集素3表达的影响，为进一步探索半乳糖凝集素3在DN中的作用奠定根基。

本测验察觉,随AGEBSA干预(24h)浓度从50、100、200到400mg・L-1不断增加,HRMC半乳糖凝集素3的表达相应增加；

选取敏感浓度200mg・L-1AGEBSA进一步测验,察觉随干预时间从0、24、48h到72h，半乳糖凝集素3的表达水平逐步升高,表明AGEBSA能呈浓度和时间凭借方式使HRMC半乳糖凝集素3表达增加。

BSA组与DMEM组相比，半乳糖凝集素3的表达轻度升高，可能由于半乳糖凝集素3可以调理细胞粘附，BSA通过细胞与蛋白的相互作用使半乳糖凝集素3的表达升高。

半乳糖凝集素3能与AGEs高亲和力结合，并参与AGEs的内化和降解。AGEs干预HRMC后，半乳糖凝集素3表达增高。这种变更可能是代偿性的增高［9］，使细胞除掉AGEs的才能增加。从这个意义上讲，半乳糖凝集素3可以通过增加AGEs的除掉，而在DN的发生中起到养护性的作用，这与Pugliese等［10］测验结果一致。Pugliese等察觉敲除半乳糖凝集素3基因的小鼠与野生型糖尿病小鼠相比，两者代谢紊乱的程度好像，但前者的肾脏和肾小球中有更明显的AGEs的积聚，表明半乳糖凝集素3的缺陷损害了对慢性高血糖形成的大量AGEs的除掉，由此认为半乳糖凝集素3可能对AGEs介导的组织损伤起了养护性的作用。其机制可能为：

（1）半乳糖凝集素3可以上调参与AGEs除掉受体（巨噬细胞清道夫受体A和AGER1）的表达，下调介导细胞激活受体（RAGE和AGER2）的表达，从而起到养护性的作用；

（2）通过目前还未知的不同于MAPK激活和氧化应激诱导的细胞内途径干扰RAGE和（或）AGE的信号转导，并可能介导AGEs的内化和降解。

然而，Pugliese等［9］早期研究察觉，AGEs在上调半乳糖凝集素3表达的同时，也可轻度升高p90的表达，揣测半乳糖凝集素3通过与p90相互作用［3］，使p90表达升高而激活细胞。

另外，半乳糖凝集素3除作为AGEs受体外，尚可通过调理细胞与基质的粘附、刺激细胞生长和增殖、巨噬细胞激活以及产生抗凋亡的效应，参与奇怪组织重构、细胞对细胞外基质粘附的变更以及组织中基质成分的积聚，促使DN的发生进展［9］。

综上所述，本研究察觉，AGEs可以使体外培养的HRMC半乳糖凝集素3表达增高，但由于它是一种在细胞内外均可以发挥作用的多功能的凝集素，它参与DN确实切机制还有待于进一步研究，对其深入研究有可能察觉预防和治疗糖尿病慢性并发症的新途径［11］。

［］［1］FRIEDMANEA.Renalsyndromesindiabetes［J］.EndocinolMetabClinNorthAm,1996,25:293324.［2］SINGHR,BARDENA,MORIT,etal.Advancedglycationendproducts:areview［J］.Diabetologia，2022，44:129146.［3］VLASSARAH,LIYM,IMANIY,etal.Identificationofgalectin3asahighaffinitybindingproteinforadvancedglycosylationendproducts(AGE):anewmemberoftheAGEreceptorcomplex［J］.MolMed,1995,1:634646.［4］李世云，孙子林，刘乃丰,等.AGEsBSA对人肾系膜细胞分泌RANTES的影响初探［J］.东南大学学报:医学版,2022，22:363365.［5］SEKIN,HASHIMOTON,SANOH,etal.Mechanismsinvolvedinthestimulatoryeffectofadvancedglycationendproductsongrowthofrataorticsmoothmusclecells［J］.Metab,2022,52:15581563.［6］ZHUW,SANOH,NAGAIR,etal.Theroleofgalectin3inendocyt