实验RNA提取方法及原理课件

实验一、RNA提取方法及原理一、研究背景二、方法及原理一、研究背景1.RNA研究的重要性DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。二、方法及原理1、RNA的提取流程

（1）样本前处理（2）细胞裂解（3）RNA的纯化及获得RNA提取流程－－样品前处理注意点

选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间去掉培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融RNA提取流程－－样品前处理中如何保存样本RNA提取流程－－

RNA的纯化及获得RNA纯化要求1纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染2.RNA提取的注意事项杜绝外源酶的污染a.严格戴好口罩，手套。b.实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。阻止内源酶的活性a.选择合适的匀浆方法。b.选择合适的裂解液。c.控制好样品的起始量。Rnase污染的10大来源

1：手指头2：枪头3：水/缓冲液4：实验台面5：内源Rnase6：RNA样品7：质粒抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶复习核酸的提取方法RNA的提取苯酚水溶液提取细胞破碎→匀浆等体积90％苯酚水溶液振荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）；DNA、Pro（苯酚层）冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂复习核酸的提取方法DNA提取浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提取也可用苯酚法，苯酚层得到DNA、ProTrizol

试剂提RNA的原理Trizol

试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂。Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。TRIzol法提取流程1.样品处理：

组织：取100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置匀浆器中，加入1mlTrizol充分匀浆，匀浆液转1.5ml离心管中,室温静置５min。2.加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3.4℃离心，13000g×15min，取上清。4.加入与上清1:1的异丙醇(约0.5ml)，将管中液体轻轻混匀，室温静置20min(-20℃，时间长效果更好)。

取200-300ul从5步往下做。TRIzol法提取流程5.4℃离心，13000g×10min，弃上清。6.加入1ml75%乙醇，洗涤沉淀,将沉淀打碎。4℃，13000g×5min，弃上清。7.100%乙醇,轻轻洗涤沉淀.(不用将沉淀打碎)8.晾干，加入适量的H2O溶解（100ul）（65℃促溶10-15min）。9.定量。RNA提取常见问题

RNA的降解

OD260/OD280

比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳RNA降解

新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品

(如脾脏，胸腺等)，很难避免

RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。RNA降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。OD260/OD280比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mM

Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。电泳带型异常

非变性电泳：上样量超