第二节微生物发酵产酶

酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample当前1页，总共103页。一酶生物合成过程（一）中心法则-CentralDogma（二）RNA的生物合成-Transcription（三）蛋白质的生物合成-Translation（四）酶生物合成的调节-Regulation当前2页，总共103页。（一）中心法则-CentralDogmaReversetranscription当前3页，总共103页。Replication复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。Transcription转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。Translation翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。Reversetranslation逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。（一）中心法则-CentralDogma当前4页，总共103页。（二）RNA的生物合成-Transcription细胞内RNA的生物功能(1)某些RNA病毒，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。(2)在蛋白质生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。(3)某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。(4)各小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。当前5页，总共103页。转录过程起始位点的识别recognition转录起始initiation链的延伸elongation转录终止termination转录后加工modification当前6页，总共103页。TheE.coliRNApolymeraseholoenzymeconsistsofsixsubunits:a2bb’s.PossiblecatalyticsubunitsPromoterspecificityEnzymeassembly,promoterrecognition,activatorbindingRoleunknown(notneededinvitro)36.5kDa15115511kDa(32-90kDa)当前7页，总共103页。当前8页，总共103页。（三）蛋白质的生物合成-Translation翻译:以RNA中mRNA为模板，按照其核苷酸顺序所组成的密码指导蛋白质的合成的过程。mRNA蛋白质翻译各种信息

各种蛋白质（核苷酸排列顺序）

（氨基酸排列顺序）当前9页，总共103页。蛋白质合成的几个要素-mRNA(模板，template)mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。以mRNA为模板，合成一定结构的多肽链的过程(翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。当前10页，总共103页。蛋白质合成的几个要素-遗传密码,nucleotidetripletcodonmRNA分子中，每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联密码。四种核苷酸编成三联体可形成64个密码子。其中：一个起始密码:AUG三个终止密码:UAAUGAUAG多数氨基酸拥有2-4个密码当前11页，总共103页。当前12页，总共103页。蛋白质合成的几个要素-转运RNA(transporter)tRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。tRNA有特异性，至少有20种。每种tRNA的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的反密码，能与mRNA上相应的密码互补结合。当前13页，总共103页。酪5’5’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密码mRNA密码(codon)与反密码(anticodon)的碱基配对当前14页，总共103页。核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。蛋白质合成的几个要素-核糖体，ribosome当前15页，总共103页。其他辅助因子工具酶蛋白质合成的几个要素-其他因子和酶当前16页，总共103页。蛋白质的合成过程肽链合成的起始initiation肽链合成的延伸elongation肽链合成的终止与释放terminationandrelease合成多肽的输送和加工transportandmodification蛋白质分子的折叠folding当前17页，总共103页。（四）酶生物合成的调节-Regulation基因水平的表达控制酶含量的调节操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。当前18页，总共103页。基因操纵子调节系统示意图

调节基因

启动基因操纵基因结构基因

DNA

转录

（-）

RNA聚合酶（+）转录

翻译

mRNA

翻译

阻遏蛋白

蛋白质

诱导剂

控制区信息区操纵子当前19页，总共103页。ABEX底物水平的调节酶水平的调节酶活性的调节酶含量的调节酶的定位调节辅助因子调节生长发育的不同时期外界环境变化酶合成与分解速度的变化（基因表达调控）产物调节细胞内酶的调控模式当前20页，总共103页。酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。当前21页，总共103页。酶合成调节的类型①诱导(induction)组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。②阻遏(repression)分解代谢物阻遏(cataboliterepression)反馈阻遏(feedbackrepression)当前22页，总共103页。3酶合成的调节机制

①酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。当前23页，总共103页。调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构

B、乳糖酶的诱导

乳糖阻遏蛋白（有活性）诱导当前24页，总共103页。②末端产物阻遏

由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

酶合成阻遏的现象：

实验：

（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。当前25页，总共103页。色氨酸操纵子——酶的阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达当前26页，总共103页。酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物当前27页，总共103页。调控方式阻遏蛋白添加物与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性－＋不转录，继而不翻译诱导物－转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性－阻遏物＋不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比当前28页，总共103页。③分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。当前29页，总共103页。分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasicgrowth）。这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。当前30页，总共103页。分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态当前31页，总共103页。二常见产酶微生物（一）基本要求：不是致病菌发酵周期短,产酶量高不易变异退化最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。对医药和食品用酶,还应考虑安全性：凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。非常见微生物制取酶,需做广泛毒性实验,包括慢性中毒实验。当前32页，总共103页。（二）常见产酶微生物1.大肠埃希氏杆菌2.醋酸杆菌（Acetobacter）3.枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）4.根霉（Rhizopus）5.曲霉（Aspergillus）当前33页，总共103页。1.大肠埃希氏杆菌简称大肠杆菌，是最为著名的原核生物。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌：易在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用：作为宿主供大量细菌病毒生长繁殖是最早用作基因工程的宿主菌生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸。当前34页，总共103页。2.醋酸杆菌（Acetobacter）应用：有机酸(食醋等）；葡萄糖异构酶(高果糖浆)；山梨糖(维C中间体）。菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。在含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。当前35页，总共103页。3.枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。当前36页，总共103页。4.根霉（Rhizopus）因有假根（Rhizoid）而得名。分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等；在酿酒工业上常用做糖化菌；有些能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。当前37页，总共103页。5.曲霉（Aspergillus）分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的产生致癌性黄曲霉毒素。代表种：黑曲霉Asp.Niger、黄曲霉Asp.flavus应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种；是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种；生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）；用作生产糖化饲料的菌种。当前38页，总共103页。酵母(1)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)啤酒酵母是啤酒工业上广泛应用的酵母。细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽汁培养基上，菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊，每个子囊含有1～4个圆形光亮的子囊孢子。啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。(2)假丝酵母(Candida)假丝酵母的细胞圆形，卵形或长形。无性繁殖为多边芽殖，形成假菌丝，也有真菌丝，可生成无节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落呈乳白色或奶油色。假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。具有较强的17-羟基化酶，可以用于甾体转化。当前39页，总共103页。（三）产酶微生物的分离和筛选样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品富集培养:投其所好，取其所抗分离：获得微生物的纯培养（pureculture）。初筛：选出产酶菌种，以多为主。复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。1.方法：当前40页，总共103页。当前41页，总共103页。2.产酶微生物优良菌种的选育诱变育种原生质体融合育种基因工程育种当前42页，总共103页。3.微生物发酵产酶方法（1）固体培养:特别适合于霉菌培养（2）液体培养:目前酶发酵生产的主要方式（3）固定化细胞:需要特殊的固定化细胞反应器当前43页，总共103页。（四）微生物酶的类型1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。当前44页，总共103页。植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um200～3001～1010～100倍增时间/h﹥120.3-6﹥15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要求不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感非常敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、单克隆抗体、酶等当前45页，总共103页。三酶的发酵工艺条件及控制当前46页，总共103页。三酶的发酵工艺条件及控制（一）培养基（二）发酵条件及控制（三）提高产酶的措施当前47页，总共103页。（一）培养基当前48页，总共103页。1.培养基的设计原则选择适宜的营养物质，营养物的浓度及配比合适物理、化学条件适宜，经济节约精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。当前49页，总共103页。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要求；培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础；五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水。1.培养基的设计原则当前50页，总共103页。水是微生物最基本的组成分（70%~95%）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水当前51页，总共103页。常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制对于一些特殊的产酶菌需要特殊的碳源，如利用黄青霉生产葡萄糖氧化酶，以甜菜作碳源就达不到产酶目的，而以蔗糖为碳源时产酶量显著提高；当前52页，总共103页。构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐氮源需要注意合适的碳氮比一般生产蛋白酶、淀粉酶多用豆饼、花生饼等有机氮源，原因是高分子氮对酶的诱导作用；而生产纤维素酶时多用无机氮源，因为有机氮会促进菌体的生长繁殖，对产酶不利。当前53页，总共103页。不同的细胞对氮源有不同的要求。应当根据细胞的营养要求进行选择和配置。一般说来，动物细胞要求有机氮源；植物细胞主要使用无机氮源；微生物细胞中，异养型细胞要求有机氮源，自养型细胞可以采用无机氮源。碳和氮两者的比例，即碳氮比（C/N），对酶的产量有显著影响。所谓碳氮比一般是指培养基中碳元素（C）的总量与氮元素（N）总量之比。当前54页，总共103页。参与酶的组成、构成酶活性基团、激活酶活性维持细胞结构的稳定性，调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物及钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。无机盐一般的无机盐在低浓度情况下有利于酶产量的提高，而高浓度对产酶有抑制作用当前55页，总共103页。生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。分类：依据化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及衍生物和类脂成分等四类。功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子。当前56页，总共103页。在酶的发酵生产中，一般在培养基中添加含有多种生长因素的天然原料的水解物，如酵母膏、玉米浆、麦芽汁、麸皮水解液等，以提供细胞所需的各种生长因素。也可以加入某种或某几种提纯的有机化合物，以满足细胞生长繁殖之需。当前57页，总共103页。细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；2.实验室的常用培养基当前58页，总共103页。例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；2.实验室的常用培养基当前59页，总共103页。枯草杆菌BF7658α-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%,糠1%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.4～5.0）。地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%,豆饼4%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%(pH8.5)。黑曲霉AS3.350酸性蛋白酶发酵培养基:玉米粉6%,豆饼粉4%,玉米浆0.6%,氯化钙0.5%,氯化铵1%,磷酸氢二钠0.2%(pH5.5)。2.实验室的常用培养基当前60页，总共103页。游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05%(pH7.2)。桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸镁0.05%,氯化钙0.04%,磷酸氢二钠0.05%,磷酸二氢钾0.05%(自然pH)。黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基:麸皮5%,果胶0.3%,硫酸铵2%,磷酸二氢钾0.25%,硫酸镁0.05%,硝酸钠0.02%,硫酸亚铁0.001%(自然pH)。枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸铵1%,氯化钾0.1%,氯化钙0.1mmol/L,氯化镁1.0mmol/L,磷酸氢二钠20mol/L(用pH7.4Tris-HCl缓冲液配制)当前61页，总共103页。（二）发酵条件及控制培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。1.pH值的控制当前62页，总共103页。通常培养条件：细菌与放线菌：pH7-7.5酵母菌和霉菌：pH4.5-6范围内生长细胞发酵产酶最适pH与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH通常接近于该酶催化反应的最适pH。有些细胞可同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。1.pH值的控制当前63页，总共103页。例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的pH值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的pH值为中性时，主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累,培养基的pH值往往会发生变化。这种变化的情况与细胞特性有关，也与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。当前64页，总共103页。◆含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使pH值向酸性方向移动；◆含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使pH值向碱性方向移动；◆以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使pH值降低；◆以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的pH值上升，然后又随着氨被细胞同化而使pH值下降；◆磷酸盐的存在，对培养基的pH值变化有一定的缓冲作用。◆在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基的pH值向酸性方向移动。当前65页，总共103页。通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度加快一倍，温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。2.温度的控制有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。枯草杆菌的最适生长温度为34～37℃黑曲霉的最适生长温度为28～32℃当前66页，总共103页。在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈代谢作用，会不断放出热量，使培养基的温度升高，同时，由于热量的不断扩散，会使培养基的温度不断降低。为此必须经常及时地对温度进行调节控制，使培养基的温度维持在适宜的范围内。◆温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。当前67页，总共103页。3.溶解氧的控制在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。当前68页，总共103页。3.溶解氧的控制调节通气量调节氧的分压调节气液接触时间调节气液接触面积改变培养液的性质控制溶氧方法当前69页，总共103页。调节气液接触面积

为了增大气液两相接触面积，应是通过培养液的空气尽量分散成小气泡。

在发酵容器的底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培养液中，是增加气液接触面积的主要方法。

装设搅拌装置或增设挡板等可以使气泡进一步打碎和分散，也可以有效地增加气液接触面积，从而提高溶氧速率。当前70页，总共103页。酶发酵生产的一般工艺流程

当前71页，总共103页。（三）提高产酶的措施1.添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。诱导物可以分3类：

酶的作用底物：青霉素是青霉素酰化酶的诱导物；

酶的催化反应产物：纤维二糖可诱导纤维素酶的产生；

底物的类似物：IPTG对β-半乳糖苷酶的效果要好于乳糖。当前72页，总共103页。2.控制阻遏物的浓度据机理不同阻遏作用分为两种：产物阻遏和分解代谢物阻遏。a.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。b.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。例如在β-半乳糖苷酶生产中，只有在培养基中不含有葡萄糖时才能够大量诱导产酶。当前73页，总共103页。2.控制阻遏物的浓度为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。当前74页，总共103页。3.添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。如霉菌发酵产纤维素酶时，加1%吐温可使酶产量提高数倍。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。当前75页，总共103页。4.添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1～20倍；添加聚乙烯醇可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。当前76页，总共103页。酶生产过程的动力学1、酶生物合成的模式2、酶生产过程中细胞生长动力学3、酶生产过程中产酶动力学GoGoGo本章目录当前77页，总共103页。1、酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。

当前78页，总共103页。同步合成型酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。

大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanaseEC3.1.1.20）。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓度活细胞浓度胞外酶浓度胞内酶浓度当前79页，总共103页。延续合成型

酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物以含有葡萄糖的果胶为诱导物当前80页，总共103页。中期合成型

该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkalinephophatase，EC3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样，在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间，培养基中的磷几乎被细胞用完（低于0.01mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30min左右，所以当细胞进入平衡期后，酶的生物合成随着停止。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml当前81页，总共103页。滞后合成型

此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。

属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成放线菌素D对产酶的影响细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml30℃22℃不加加入不加加入当前82页，总共103页。理想的酶合成模式酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株,并通过工艺条件的优化控制,使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。其中对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度是可取的措施；对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；而对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。回本节当前83页，总共103页。2、酶生产过程中细胞生长动力学细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年，法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程。在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，μ为这种限制性基质浓度的函数。KS为莫诺德常数，是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。当前84页，总共103页。回本节限制性基质的物料平衡式莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的各种动力学模型。连续培养时的方程变化形式当前85页，总共103页。3、产酶动力学

产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为非结构动力学。也可以从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学或称为结构动力学。当前86页，总共103页。在酶的发酵生产中，酶的产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集中体现，宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、