大肠杆菌表达体系介绍

大肠杆菌表达体系介绍第1页/共91页表达系统背景工业酶应用：洗涤酶、纺织酶、饲料酶、果汁酶、烘焙酶、酿造酶工业酶与我们的日常生活息息相关。第2页/共91页市场

摘自novozymes《2012年报》

（1）市场容量小---全球市场约250-300亿元人民币（2）产能大、价低、技术密集型第3页/共91页市场需求：纺织酶从全球来看，纺织酶大概占酶制剂行业10%左右，规模在2.5亿元美金，中国市场目前市场规模在6个亿左右，但主要为外资占据，国内企业基本处于竞争弱势，但国内市场将会维持持续高增长。纤维素酶：尤特尔、夏盛、江西博兰、高宝、康地恩（蔚蓝），中温淀粉酶：江阴百圣龙、杰诺、其他淀粉酶公司除氧酶：无，几家企业在产业化开发中（江南大学的技术）碱性果胶酶：无，几家企业在产业化开发中（江南大学的技术）典型企业：目前市场增长：15%左右市场预期市场格局第4页/共91页纺织酶主要品种市场预期及发展现状品种功能使用条件最优使用条件产业化情况预期市场淀粉酶低温退浆酸性条件40-80oC宽温宽pH国内、国外酶均有稳步增长纤维素酶抛光、牛仔水洗、柔软整理酸性4，5-5.5近中性5.5-6.5近中性，作用效果优，失重小酸性国内国外均有，中性国内尚未产业化稳步增长，当前是纺织酶中市场最大除氧酶漂白后除氧不调pH值，碱性条件下宽温宽pH国外有，国内目前江南大学产业化初步阶段稳步增长>3000吨果胶酶精炼碱性碱性条件诺维信等少数国际公司产业化，国内产业化初步阶段市场空间较大>5000吨漆酶牛仔水洗低温皂洗染料废水脱色酸性近中性目前尚无商业化，成本高未来皂洗、染料废水脱色市场空间大第5页/共91页市场需求：动物饲料酶

从长远来看，饲料仍然有较大的市场发展空间，其将在一定时间内保持较高增长。而从目前产品结构来看，植酸酶在饲料市场占有较高的份额。

广东溢多利—我国最大的动物饲料酶公司北京昕大洋—植酸酶生产及制剂挑战集团—植酸酶的龙头企业，及动物饲料和饲料添加剂其他：康地恩、新华扬、夏盛等公司典型企业：市场产品结构市场空间（吨）第6页/共91页品种功能使用条件最优使用条件产业化情况预期市场植酸酶降解饲料中有机磷，减少无机磷的添加酸性条件（pH2-6.5），37oC动物肠胃环境宽pH，酸近中性，热稳定好，低温37oC活力高国内成功实现产业化，且活力不断提高，主要是国产酶需求量稳步增长，市场潜力大（产能盲目扩张导致价格下降）木聚糖酶降解饲料中木质素同上宽pH，酸近中性，热稳定好，低温37oC活力高自主产业化，改变依靠进口的局面，活力高稳步增长纤维素酶降解饲料中纤维素同上同上小品种酶，主要用于复合酶、国内有产业化稳步增长，但量小淀粉酶水解淀粉类饲料同上同上小品种酶，主要用于复合酶、国内有产业化稳步增长，但量小蛋白酶蛋白类饲料同上同上小品种酶，主要用于复合酶、国内有产业化稳步增长，但量小非淀粉多糖酶（NSP）非淀粉类多提，果胶，木聚糖、甘露聚糖、葡聚糖等）同上同上除木聚糖酶外，国内实现产业化，其他需进口稳步增长，但量小动物饲料酶第7页/共91页市场需求：其它领域

中国在洗涤剂用酶行业发展一直较为缓慢。主要是与特定的洗涤方式和洗涤剂的形式决定的。如洗涤剂主要还是以粉状为主，液体较少，而事实上液体洗涤剂中酶的加入更容易，更普遍，且更易洗涤。此外，中国更多是冷水洗涤，20oC左右，而欧美的洗涤温度30-40oC。而国内当前低温洗涤用酶的开发很少。因而洗涤用酶市场需求并未得到有效激发洗涤用酶淀粉深加工酶食品用酶其它用酶:如新能源、皮革、造纸等领域在淀粉加工行业，酶作为重要的必要的催化剂，其需求将保持持续稳定，如糖化酶：市场稳定，供过于求；淀粉酶：高品质酶有需求，需求稳定；葡萄糖异构酶：市场需求稳定；普鲁兰酶：市场需求稳定酶在其它新兴领域，如新能源等领域有着潜在的市场需求，目前一些企业正在开发。但基本都处在研发阶段，如DSM、诺维信、杰能科；DSM：美国市场（中试乙醇厂），纤维素酶+辅酶化学工艺相结合；诺维信：国内与中粮战略合作，中试工厂；杰能科+Dupont：合作生产纤维素乙醇。国内一些厂家也在开发试验，如中科院过程所、中科院微生物所、天津工生所、山东大学等其它领域，如皮革、造纸等领域也正逐渐兴起。随着食品工业与酶制剂行业的发展，特别是绿色、高质量食品将对酶制剂表现出持续的需求，如糖化酶、淀粉酶、低聚糖等在果汁加工、酿造、肉类处理、啤酒等行业有着广泛的需求。第8页/共91页常用微生物表达系统类型菌株原核Escherichiacoli

BacillussubtilisPseudomonasfluorescens荧光假单胞菌Streptomyceslividans变铅青链霉菌Lactococcuslactis乳酸乳球菌

酵母

Hansenulapolymorpha汉逊酵母Kluyveromyceslactis乳酸克鲁维酵母

Pichiapastoris

Saccharomycescerevisiae

丝状真菌

ChrysosporiumlucknowenseNeurosporacrassa链孢霉Trichodermareesei瑞氏木霉Aspergillusniger/oryzae第9页/共91页

表达系统工业生产：菌株、发酵工艺和后提取方法等摘自《MicrobialExpressionSystemsandManufacturingfromaMarketandEconomicPerspective》Thegoodproductionstrainisnoteverything,buteverythingisnothingwithoutagoodproductionstrain.菌株：诱变选育高产菌和基因工程菌第10页/共91页工业酶表达系统特点：酶蛋白高效表达系统：是酶制剂开发和应用最关键的技术工业化应用的表达系统评价的四个指标易操作性转化，筛选、遗传稳定可延展性蛋白种类，放大低成本性发酵原料，发酵工艺和后处理高效表达副产物少，表达量高第11页/共91页常用工业酶表达系统的表达水平种类菌名表达水平举例目的蛋白总蛋白细菌大肠杆菌<7g/l枯草芽孢杆菌20g/l淀粉酶/蛋白酶酵母毕赤酵母<7-10g/l<20g/l木聚糖酶，植酸酶等丝状真菌黑曲霉<20g/l>50g/l糖化酶米曲霉<20g/l>50g/l淀粉酶里氏木霉<50-60g/l>80g/l纤维素酶金孢子菌C1<60g/l>100g/l纤维素酶第12页/共91页大肠杆菌蛋白表达系统枯草芽孢杆菌蛋白表达系统酵母蛋白表达系统丝状真菌蛋白表达系统第13页/共91页外源基因在大肠杆菌中的表达第14页/共91页外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物第15页/共91页外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素第16页/共91页外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数转录水平翻译水平第17页/共91页Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列PlacTT

TACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

PtraATAGACATAATGT

PlLTTGACA

GATACT

PrecATTGATA

TATAAT启动子第18页/共91页

转录调控机理

具有多顺反子结构，基因排列次序为：

启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）

正调节因子CAP

负调节因子

lacI启动子Lac

表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

第19页/共91页lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效转录cAMPCAPlacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录Lac

表达系统

正调节因子CAPcAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与

lac

操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac

介导的转录。RNA聚合酶RNA聚合酶基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAP第20页/共91页Lac

表达系统

lacUV5突变体

PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受

lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。第21页/共91页Lac

表达系统

负调节因子

lacI

在无诱导物情形下，

lacI

基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNA第22页/共91页Tac

表达系统

tac启动子是由

trp的–35序列和

lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。

调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5

启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrp

TTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

第23页/共91页lac、tac

启动子对宿主菌的要求

在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。

当多拷贝的

lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO

的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。第24页/共91页lac、tac

启动子对宿主菌的要求为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI

基因的突变体lacIq

被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq

，常被选用为Lac、Tac

表达系统的宿主菌。

但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。

需在表达载体中插入lacIq

基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。第25页/共91页lac、tac

表达系统存在的问题

IPTG用于诱导

lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。

一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG

解决方法

lac

和tac启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代IPTG诱导lac

和tac启动子的转录第26页/共91页lac、tac

表达系统存在的问题

lac

和tac启动子的转录受温度严紧调控

把阻遏蛋白LacI的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac

和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。用乳糖替代IPTG诱导lac

和tac启动子的转录

乳糖在b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代lPTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。第27页/共91页

转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp

介导的目的基因表达启动子Trp

表达系统

以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统

第28页/共91页Trp

表达系统

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效转录mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶在有高浓度Trp存在时,阻遏蛋白trpR-色氨酸复合物形成一个同源二聚体,并且与色氨酸操纵子紧密结合,因此可以阻止转录第29页/共91页PL

和PR

表达系统

以l噬菌体早期转录启动子PL、PR

为核心构建的表达系统

在野生型l噬菌体中，PL

、PR

启动子转录与否决定了l

噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。启动子第30页/共91页PL

和PR

表达系统

转录调控的机理由

l噬菌体PE

启动子控制的cI基因的产物是PL、PR启动子转录的阻遏物。cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI

基因产物的产生和消失是相当困难的。

因此PL、PR

表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控PL、PR

启动子的转录。在较低温度（30℃）时以活性形式存在在较高温度（42℃）时失活脱落第31页/共91页PL

和PR

表达系统宿主菌中没有cI基因产物，PL、PR启动子的高强度直接转录，带有PL

或

PR启动子的表达载体在普通大肠杆菌中很不稳定。

对宿主菌的要求

用溶源化

l噬菌体的大肠杆菌作PL、PR

启动子表达载体的宿主菌

N4830-1，POP2136等菌株已经溶源化cI857(ts)

l

噬菌体，可用作表达外源基因时的宿主菌。

把cI857(ts)

基因组装在表达载体上

宿主菌选择范围更大第32页/共91页PL

和PR表达系统存在的问题

由于PL和

PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或

PR表达系统。

缺陷在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃

提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。第33页/共91页

T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。第34页/共91页T7表达系统

T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。第35页/共91页T7表达系统

转录调控的机理

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA

聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

化学诱导型温度诱导型双质粒系统T7RNA

聚合酶T7启动子目的基因

T7RNA聚合酶基因？启动子第36页/共91页T7表达系统转录调控的机理

化学诱导型噬菌体DE3是

l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5

启动子和T7RNA聚合酶基因的

DNA片段被插入其

int基因中

用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。

T7RNA聚合酶基因

lac

启动子E.Coli（DE3）T7启动子目的基因T7RNA

聚合酶IPTG诱导第37页/共91页T7表达系统转录调控的机理温度诱导型

PL

启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发

T7噬菌体启动子的转录。

这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。

T7RNA聚合酶基因PL

启动子E.Coli（CE6）T7启动子

目的基因T7RNA

聚合酶热诱导cI857第38页/共91页T7表达系统转录调控的机理

双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因

两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型T7RNA

聚合酶热诱导T7启动子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

启动子

cI857

p15Aori

KanRColE1oriAmpR第39页/共91页T7表达系统存在的问题

T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。解决办法之一在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与

T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质粒导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。第40页/共91页

营养调控型采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因

phoA启动子或甘油3’-磷酸转移系统ugp

启动子构建表达载体。

这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi﹥5mmol/L

时抑制，Pi﹤1mmol/L时激活)，具有较高的转录水平。其他表达系统第41页/共91页

糖原调控型采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统（mglBAEC)mgl启动子或沙门氏菌阿拉伯糖基因araB启动子构建表达载体。

这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。其调控机理类似于Lac表达系统.其他表达系统第42页/共91页

pH调控型采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因cadA启动子构建表达载体。

cadA启动子受培养基中H+浓度，即pH值调控。（在pH﹥8时抑制，pH﹤6时激活，pH=6时转录活力最高）。

该表达系统要求菌体发酵温度控制在27～30℃之间才能使目的基因得到稳定的表达.其他表达系统第43页/共91页强化转录终止的必要性

外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物，过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率终止子第44页/共91页强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。

终止子对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用第45页/共91页核糖体结合位点

外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与

mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。

mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）

核糖体结合位点第46页/共91页核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：

位于翻译起始密码子上游的6–8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’

即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；

翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子

SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5’端若干密码子的碱基序列核糖体结合位点第47页/共91页核糖体结合位点对外源基因表达的影响

SD序列的影响一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG）序列与

16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG

四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低核糖体结合位点第48页/共91页核糖体结合位点对外源基因表达的影响

SD序列与起始密码子之间的序列的影响

SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而

CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。

紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍核糖体结合位点第49页/共91页核糖体结合位点对外源基因表达的影响

SD序列与起始密码子之间的距离的影响

SD序列与起始密码子AUG

之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。

在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低核糖体结合位点第50页/共91页核糖体结合位点对外源基因表达的影响起始密码子及其后续若干密码子的影响大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG

三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的

50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的

5’端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位

目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。核糖体结合位点第51页/共91页

不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体φX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能性中等强度规律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多细胞内tRNA的含量密码子生物体对密码子的偏爱性第52页/共91页密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响

由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。

一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因第53页/共91页质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降

解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道第54页/共91页

外源基因在大肠杆菌中的表达蛋白质的合成是在细胞中进行的目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是：表达质粒的构建比较简单；能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总蛋白的

20%～40%。目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：

在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒包涵体存在于大肠杆菌细胞质中

在细胞内表现为可溶性的蛋白质

可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分泌到周质空间，或分泌到培养液中。第55页/共91页大肠杆菌基因工程菌的构建策略

包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建外源基因在大肠杆菌中的表达第56页/共91页包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，异源蛋白质在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子包涵体型异源蛋白的表达第57页/共91页以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点

包涵体表达形式的优点在一定程度上保持表达产物的结构稳定能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集

简化外源基因表达产物的分离操作包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白包涵体型异源蛋白的表达第58页/共91页以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点

包涵体表达形式的缺点以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。

经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白质，尤其当目标蛋白分子中的

Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%

复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。包涵体型异源蛋白的表达第59页/共91页包涵体的变性与复性操作

包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键。在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。

能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：清洗剂SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化促溶剂盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应混合溶剂如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强极端pH廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应包涵体型异源蛋白的表达第60页/共91页包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）包涵体的复性与重折叠的主要任务：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠通过次级键的形成使蛋白质复性包涵体型异源蛋白的表达第61页/共91页在细胞内表现为可溶性的蛋白质

目标蛋白以可溶性蛋白质形式表达虽然可以避免包涵体复性带来的问题，但是也有一定的缺陷，主要表现为大肠杆菌本身存在于细胞质中的蛋白质往往只含有少量的，甚至没有半胱氨酸残基。富含半胱氨酸残基，需要形成二硫键的蛋白质大部分被转运到细胞的其他部位。

分泌型异源蛋白的表达第62页/共91页

这是因为大肠杆菌细胞质微环境的氧化还原态势不利于蛋白质二硫键的形成，而且缺少一种形成二硫键所必须的体系。一些需要通过二硫键的形成来维持其构象的目标蛋白在大肠杆菌的细胞质中往往不能正确折叠。解决这一问题的途径之一是用大肠杆菌氧硫还蛋白还原酶基因trxB缺陷株作为宿主菌表达目标蛋白。研究表明trxB缺陷株细胞质的氧化还原态势发生了变化，蛋白质在trxB缺陷株的细胞质中能够形成二硫键。这一菌株对于表达结构复杂的蛋白质而言是一·个相当重要的工具。分泌型异源蛋白的表达第63页/共91页目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达

与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。

目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。

金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，谷胱甘肽-S-转移酶（GST），大肠杆菌麦芽糖结合蛋白MBP，His-tag等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。第64页/共91页GST第65页/共91页目标蛋白在周质空间中表达目标蛋白在周质空间中表达的优点⑴大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为100种，只占菌体总蛋白数量的4%。蛋白水解酶的含最与在细胞质中相比也少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。⑵目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了N端附加的甲硫氨酸的产生。⑶周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠，维持正确的构象。第66页/共91页目标蛋白分泌表达

把所表达的目标蛋白分泌到细胞外的培养基中可以进一步减少蛋白水解酶的降解，也有利于分离纯化。目前成功的例子主要是采用以下方案:

（1）与大肠杆菌本身的分泌蛋白基因融合表达（2）与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达（3）改变培养基的成分归纳现有的研究结果显示这些方法仅对分泌分子量较小的蛋白有效，而且分泌效率一般都比较低。第67页/共91页高效表达目标基因的战略和技术表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性高密度发酵和工程化宿主细胞第68页/共91页高效表达目标基因的战略和技术表达质粒的优化和设计构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG与SD序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。核糖体结合位点序列的变化对mRNA的翻译效率有显著影响，具体表现为：

SD序列UAAGGAGG的翻译效率要比AAGGA高3～6倍翻译起始密码ATG与UAAGGAGG的最适距离是6～8个碱基长度，与AAGAA的最适距离是5～7个碱基长度

ATG与UAAGGAGG至少相隔3～4个碱基，与AAGAA至少相隔5

个碱基；mRNA的翻译才能进行

ATG与SD序列之间的碱基组成为A，T碱基丰富时，mRNA翻译效率较高。第69页/共91页

核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因mRNA5’端的二级结构，研究表明mRNA5’端形成的“茎环”结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中A/T碱基的含量，降低mRNA5’端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA5’端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下第70页/共91页表达质粒的优化和设计

在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列能提高mRNA翻译效率的特殊核苷酸序列，称为翻译增强子。

高效表达目标基因的战略和技术第71页/共91页共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因表达水平高的基因呈现的密码子偏爱性高于表达水平低的基因。现已阐明的在大肠杆菌中的稀有密码子有：编码Arg的密码子AGA、AGG、CGA、CGG

编码Pro的密码子CCC、CCU、CCA

编码Cys的密码子UGU、UGC;

编码Gly的密码子GGA、GGG

编码Leu的密码子CUA、CUC

编码Ile的密码子AUA

编码Ser的密码子UCA、AUG、UCG、UCC

编码Thr的密码子ACA高效表达目标基因的战略和技术第72页/共91页共表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因

由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。解决这一问题的办法：通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子。在表达系统中共表达稀有密码子tRNA基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子tRNA的丰度高效表达目标基因的战略和技术第73页/共91页提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性

由于大肠杆菌防御体系的自身保护作用，大肠杆菌中的核酸酶和蛋白水解酶能够降解目标基因mRNA和目标基因产物，这种降解作用程度对不同的基因或蛋白质而言是不同的，具有一定的专一性和选择性。高效表达目标基因的战略和技术第74页/共91页蛋白水解酶的特点细胞质是蛋白水解酶含量最多的区域，目标蛋白在细胞质中最容易受到蛋白水解酶的作用。通过对已知大肠杆菌细胞内半衰期的蛋白质的统计学分析，发现N末端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr、Trp残基的蛋白质，含有ProGlu、Ser、Thr丰富区的蛋白质容易降解，稳定性较差。

在细胞内有多肽碎片、突变的异常蛋白和外界物理因素的刺激的条件下，大肠杆菌细胞内的蛋白水解酶活力往往能达到比较高的水平。高效表达目标基因的战略和技术第75页/共91页提高目标蛋白的稳定性的措施主要有：利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间，或分泌到培养基中采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌。对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达。共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因。对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造。在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。高效表达目标基因的战略和技术第76页/共91页

但必须指出的是，由于目标蛋白本身的性质和用途的不同，上述几种方法在使用上是受到一定的限制的。主要表现为：大肠杆菌对分子量较大的目标蛋白的转运和分泌效率一般比较低，不能满足大规模制备的需要。

蛋白水解酶含量低的菌株往往代谢不旺盛，生长速率慢，使高密度发酵比较困难。融合表达使目标蛋白的构象与天然状态不一样，导致生物比活力降低，甚至没有活性。融合蛋白和串联聚合蛋白需要用酶或化学的方法切割出单体目标蛋白。酶法成本比较高且加入的酶蛋白还必须分离去除。化学法比酶法成本低，但不少裂解试剂有毒性。对蛋白质序列进行改造需要有基本的蛋白质结构数据，而目前这方面的数据库还不完整。第77页/共91页高效表达目标基因的战略和技术高密度发酵和工程化宿主细胞

大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种第78页/共91页构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌

高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用。这是高密度发酵工艺研究中最迫切需要解决的问题。虽然在发酵过程中可采取通氧气，提高搅拌速度，控制补料速度等措施来控制溶氧饱和度，减少乙酸的产生。但从实际应用上看，这些措施都有一定的滞后效应，难以做到比较精确的控制。因此构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌，是从根本上解决问题的途径之一。高效表达目标基因的战略和技术第79页/共91页

利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因vgb

导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值。用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因pta1

和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断。改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因pdc1和乙醇脱氢酶基因adh2导入大肠杆菌，使丙酮酸的代谢有选择地向生成3‘-羟基丁酮或乙醇的方向进行。高效表达目标基因的战略和技术第80页/共91页构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌对于以可溶性或分泌形式表达的目标蛋白而言，随着发酵后期各种蛋白水解酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解酶的作用而被降解。为了使对