动物肌肉发育中环状RNA的作用探讨,发育生物学论文

动物肌肉发育中环状RNA的作用探讨,发育生物学论文摘要：环状RNA是一种具有环状构造的非编码RNA,在转录经过中出现,由单链RNA分子通过共价结合构成环形。环状RNA在植物和动物机体中广泛分布,主要承当了与蛋白质结合、调控转录等生物功能,对动物的肌肉发育也有重要的调控作用。文章综述了环状RNA的发现、合成与特征、检测方式方法及生物学功能,介绍了环状RNA在动物肌肉发育中的研究进展,瞻望了环状RNA的研究应用前景。本文关键词语：环状RNA;内含子;外显子;基因表示出;生物功能;Abstract：CircRNAsisakindofnon-codingRNAwithringstructure,whichappearsintheprocessoftranscriptionandisformedbycovalentbindingofsingle-strandedRNAmolecules.ThecircRNAsarewidelydistributedinplantsandanimals,whichmainlyplaystherolesofbindingtoproteinsandregulatingtranscription,andalsoplaysanimportantroleintheregulationofanimalmuscledevelopment.Inthispaper,thediscovery,synthesis,characterization,detectionmethodsandbiologicalfunctionsofcircRNAswerereviewed.TheresearchprogressofcircRNAsinanimalmuscledevelopmentwasintroducedandtheprospectofitsapplicationwasprospected.Keyword：circRNAs;intron;extron;geneexpression;biologicalfunction;H.L.Sanger等[1]最先通过分离植物病毒和动物肝炎病毒发现了环状RNA,从此环状RNA被人所认知。环状RNA主要有两种构成机制,一种为外显子环状RNA,另一种为内含子环状RNA,它们都各自有着不同的功能和作用。近年来,人们通过生物学方式方法和高通量测序方式方法等检测到了环状RNA并对其生物功能(miRNA海绵、调控转录以及结合蛋白等)进行了深切进入研究。当前已有很多关于环状RNA对动物肌肉细胞发育、繁衍以及调控方面的研究,但对于环状RNA与miRNA存在互相辨别的结合位点以及环状RNA对骨骼肌等的调控作用研究还很少,而这些都将成为将来动物研究的热门。文章综述了环状RNA的发现、合成与特征、检测方式方法、生物学功能及环状RNA在动物肌肉发育中的研究进展,并瞻望了环状RNA的研究应用前景,以期对环状RNA的研究及应用提供参考。1、环状RNA的发现在1976年,H.L.Sanger等[1]率先发现了环状RNA的存在,轰动了学术界。W.R.Jeck等[2]提出早在H.L.Sanger等发现环状RNA之前就有人观察到环状RNA,但由于没有证据,所以不了了之。1979年,M.T.Hsu等[3]在显微镜下观察到在植物细胞中有环状RNA的存在,进而揣测在真菌甚至病毒等生物中都普遍存在环状RNA。其后陆续在人[4]、猴子[5]、猪[6]等生物的细胞中检测到了环状RNA的存在以及它们介入重要生命活动的线索。J.Salzman等[7]研究结果表示清楚,环状RNA很有可能是细胞遗传经过当中的重要转录产物。此后,环状RNA逐步走进人们的视野中,开场成为研究热门。2、环状RNA的合成与特征环状RNA有两种构成机制,一种为外显子发生跳读,进而发生索套构造产生驱动作用,另一种为内含子互补配对发生驱动环化[8]。W.R.Jeck等[8]使用Map-Splice分段读取算法,检测并且辨别到了反向链接的片段。S.Memczak等[9]的研究结果表示清楚,外显子环化是大多数环状RNA的构成方式。通常RNA由5端头部和3端尾部组成,而这种机制下构成的环状RNA是通过首尾反向互补链相连,即5端与3端相连[4,10],进而构成外显子环化。同时,ZhangX.O.等[11]用特殊的RNaseR对环状RNA处理之后进行PCR扩增,发现大量环状RNA存在于人体胚胎干细胞H9内。2.1、外显子环化在科学家对外显子环化的研究中,衍生出了两种假设,一种是RNA内部剪切,内含子被去除进而发生RNA序列环化。这是由于RNA出现了局部折叠现象,使得外显子在转录经过中发生跳读,并生成一个外显子包裹内含子的环状RNA套索构造。而另一种则是由于环状RNA的前体在合成经过中出现反向互补[12,13]。2.2、内含子驱动环化基于这种机制所构成的环状RNA,在内切酶的影响下,其内含子的套索构造构成后发生脱酚作用进而发生相应的退化[7,14]。但是一些研究结果显示,某些含有特定序列的内含子不会出现脱酚反响,进而不能构成来源于内含子的环状RNA。有研究结果表示清楚,由于环状RNA在被脱支酶或无介导降解机制作用后,产生的产物和中间体会变得不稳定易衰亡[15],因而内含子驱动环化的构成机制和外显子跳读的构成机制不易区分。2.3、环状RNA的特性由于认知和技术方面的限制,初期对环状RNA的研究特别有限。但根据当下的研究发展来看,环状RNA在生命活动中的地位举足轻重。经过科学家验证,环状RNA包含两种重要特性:1)广泛性。J.Salzman等[7]使用RNA高通量测序法发现10%的人体基因能转录出环状RNA,大致与链型RNA的转录量差不多。S.Memczak等[9]研究结果表示清楚,在不同种类人体细胞中已经发现了上千种环状RNA,对小鼠RNA的分析也同样揭示了成千上万个明显的循环转录组。2)稳定性。环状RNA在细胞中非常稳定,其半衰期是mRNA的四倍多[10,16]。环状RNA的成环位置由2～5的磷酸二酯键相连,因而环状RNA对RNA脱支酶有一定抗性[16]。3、环状RNA的检测由于大部分的环状RNA都是由外显子成环机制构成的,因而文章主要介绍外显子环化所构成的环状RNA的检测方式。3.1、生物学方式方法由于环状RNA呈环形,两端互补链接,构造较为稳定,相较于一般RNA,环状RNA在电泳中移动得较慢,因而能够使用加强型交联凝胶法放大效果[17]。环状RNA含有较少的总核苷酸序列,使得其在弱交联凝胶中移动缓慢。生物学检测方式方法主要有三种,即诺瑟杂交法、电泳法以及酶法。1)诺瑟杂交法[18]:该方式方法从细胞或者样本中提取到其RNA序列,然后再使用纤维素层析分离出带有poly(A)尾的真核mRNA;再将其置入凝胶电泳中,通过电泳分离RNA样品。由于凝胶容易被毁坏,探针不能轻易进入到RNA基质中,因而通过吸管(毛细管)将分离出来的RNA样品放置到尼龙膜上进行进一步分析。2)双向凝胶电泳法和琼脂糖电泳:相对于低交联的凝胶电泳,环状RNA在高度交联的电泳中有着更低的迁移率。环状RNA与融化的琼脂糖混合后,被穿插连接所困,导致其在电泳经过中不发生迁移,进而能测定环状RNA[19]。3)酶法[20,21]:固然外显子核酸内切酶RNaseR、酸性磷酸酯酶和外显子核酸终止子外切酶这三种酶无法作用于环状RNA,但能够用于降解直链型RNA,因而通过这三种酶能够对特定RNA种类进行量化,进而揭示环状RNA丰富的种类。3.2、高通量测序法传统经典的分子生物学检测法在环状RNA的功能验证上具有重要作用,但对发现物种新的环状RNA效果欠佳,而高通量测序法的出现则解决了这一窘境。环状RNA是通过反向剪接产生的,但是利用原始算法无法准确判定出RNA反向剪接的位点和相应的环状构造。当前可应用于环状RNA分子研究计算的方式方法有segemehl[22]、CircSeq[9]、Map-Splice[23]等。高通量测序法能够定位末端,测出腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的顺序,进而到达准确测序的目的[24]。4、环状RNA的生物学功能在对基因组的分析经过中,发现了大量的外显子环状RNA。环状RNA不仅对物种的多样性以及进化保守性的调控起重要作用,而且在细胞调控和繁衍中也发挥着重要的生物学作用[13]。4.1、miRNA海绵研究结果表示清楚,在miR-7和miR-138的存在下,从人和小鼠的CDR1as/ciRS-7中所得到的环状RNA和小鼠Y染色体(sex-determiningRegionontheYChromosome,Sry)与miRNA的受体蛋白密切相关[9,21]。CDR1as/ciRS-7包含74个miRNA结合位点,而环状RNASry包含16个miR-138的结合位点。miRNA的结合不会毁坏这两个特殊的RNA,相反,它会与miRNA和目的编码基因发生结合,进而降低miRNA介导的后转录抑制的作用。结果表示清楚,过表示出CDR1as/ciRS-7或Sry的环状RNA增加了miRNA靶向构造的表示出,进而起到了负调节的作用。以上结果是由T.B.Hansen等[25]对小鼠Y染色体的非同源区段(Srysex-determiningregion)进行miRNA海绵翻译程度的研究所得出的重要推论。大量试验结果表示清楚,环状RNA不存在大量的miRNA结合位点[26],推翻了当时提出的miRNA海绵和环状RNA在功能上没有差异的理论。4.2、调控转录环状RNA能够通过调控亲代基因模版链,进而调控转录经过。由于环状RNA能够被以为是选择性剪切的异构体,因而它们可能会在基因表示出水平上起到调节作用,华而不实可能有两种情况:1)构成多种能翻译得到功能性蛋白质的miRNA的异构体;2)减少规模化拼接的模板链。由于没有足够的证据证明存在有能够直接发生转录的环状RNA,所以第一种情况不太可能实现。LiZ.等[27]研究结果表示清楚,从细胞核中检测到了内含子环状RNA以及RNA聚合酶的存在,而聚合酶能够作用于环状RNA,进而减少规模化拼接的模板链,进而起到调控转录的作用;同时还发现了一种由内含子组成的一类环状RNA,被称为环状长链非编码RNA,并指出此类RNA介入了转录调控的经过。R.Ashwal-fluss等[28]研究结果表示清楚,亲代基因中的cis会被环状RNA调控支配,而这也是环状RNA介入调控的一种机制。在剪切经过中,环状RNA与对应呈线性关系的U1snRNP互相作用,进而使亲代基因中的cis含量发生上调。4.3、结合蛋白质环状RNA能够与蛋白质相结合进而介入生命活动。例如,环状RNA能够与AGO蛋白结合[9]。环状RNA能够与RNA聚合酶Ⅱ相结合[8],同时还能够与甘露糖结合凝集素相结合[9],表示清楚环状RNA可能起到了支撑构造的作用,同时也表示清楚环状RNA对转录具有调节作用。一些环状RNA能够通过其翻译的内部核糖体进入辨别点(IRES)进而进行翻译,并且只要一个辨别点以及ATG的环状RNA就能够进行翻译。例如:环状RNA介入了甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒等的合成[29]。5、环状RNA在动物肌肉发育中的研究进展5.1、环状RNA在牛肌肉发育中的研究进展魏雪峰[30]通过高通量测序技术在不同生长时期的秦川牛(90天和24个月)肌肉中检测到两个年龄段共同存在的环状RNA有2400个,包含828个差异表示出,华而不实circLMO7的表示出程度较高;circLMO7通过与miR-378a-3p结合,使靶基因HDAC4再次表示出,进而促使肌细胞增殖,抑制其分化。ZhangC.L.等[31]发现,除了激素和蛋白质以外,非编码RNA分子在牛奶蛋白质合成中也起着重要调节作用,华而不实环状RNA通过调控其亲代基因进而进行表示出;利用RNA-seq的deepRNA测序技术,比照了产后90天和250天母猪乳腺分离出来的RNA样本,得到4084个环状RNA,华而不实只要2231个环状RNA在哺乳期共同表示出,表示清楚环状RNA有着高度的阶段特异性。经过测定,共有80个环状RNA来自于牛乳腺中的4个酪蛋白编码基因(CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3),华而不实来自于CSN1S1的环状RNA有着较高的丰度[31]。这些环状RNA在miRNA-2284序列存在一些靶点,并以CSN1S1和CSN2mRNA作为目的RNA,表示清楚环状RNA可能介入酪蛋白的表示出调控。5.2、环状RNA在猪肌肉发育中的研究进展LiangG.等[32]比照了0,30,240日龄猪的骨骼肌,结果表示清楚在0～30日龄,环状RNA对骨骼肌的生长发育以及肌纤维类型转换进行了调控;在30～240日龄时,环状RNA对骨骼肌糖代谢和钙离子信号进行了调控,讲明环状RNA对肌肉生长有着直接的联络。SunJ.等[33]通过Ribo-ZeroRNA测序技术,在长白猪和蓝塘猪中检测到了4360个环状RNA存在差异表示出,而华而不实分别来自93个功能性宿主基因的236个环状RNA介入了肌细胞的生长。该试验发现了一种新的转录后调节机制,将来能够对肌纤维在不同品种猪中的发育进行更深切进入研究。5.3、环状RNA在羊肌肉发育中的研究进展LiC.等[34]在羊胚胎时期的背最长肌(LDM-E)以及成年时期的背最长肌(LDM-A)的RNA序列中总共发现了5086个环状RNA的差异性表示出,包括2940个上调环状RNA和2146个下调环状RNA,背最长肌中环状RNA的实时定量PCR分析结果表示清楚,circRNA00002456、circRNA0000552、circRNA00004676、circRNA00004690以及circRNA0000666的表示出在LDM-E中相对高于LDM-A,相反circRNA0005256、circRNA0003451、circRNA0005243以及circRNA0005250的表示出在LDM-A中相对高于LDM-E。进而证明了环状RNA在羊肌肉中的差异性表示出。CaoY.等[35]从绵羊骨骼肌RNA基因库中提取到7550万个序列;这些序列被绘制到绵羊的参考基因组中的729个基因上,总共发现了886种环状RNA,华而不实包括很多内含子环状RNA和外显子环状RNA。逆转录PCR和DNA测序分析证实了多种环状RNA的存在,也证明了绵羊环状RNA对RNaseR的消化具有抗性。最终发现大部分环状RNA通过与肌肉特异性miRNA互相作用,进而介入肌肉生长发育的调控,尤其是circ776。GO基因富集分析和KEGG富集分析结果表示清楚,环状RNA的宿主基因介入肌细胞的发育和信号传导。6、发展前景当前环状RNA是一个非常热门的研究课题,它的发现引起了学术界的重视,也逐步揭开了它的神秘面纱。环状RNA具有独特的生物功能,在生物的生长、发育、衰老等生命活动中起到了非常重要的调控作用。同时,由于它的丰富性和保守性等特性的存在,使它成为了新型生物载体。当前科研人员对环状RNA的研究还在继续深切进入,相信随着生物科技的进步和将来对环状RNA越来越深切进入的研究将会在医学以及动植物基因表示出功能研究中起到非常重要的作用。以下为参考文献[1]SANGERHL,KLOTZG,RIESNERD,etal.Viroidsaresingle-strandedcovalentlyclosedcircularRNAmoleculesexistingashighlybase-pairedrod-likestructures[J].ProcNatlAcadSciUSA,1976,73(11):3852-3856.[2]JECKWR,SHARPLESSNE.DetectingandcharacterizingcircularRNAs[J].NatBiotechnol,2020,32(5):453-461.[3]HSUMT,COCA-PRADOSM.ElectronmicroscopicevidenceforthecircularformofRNAinthecytoplasmofeukaryoticcells[J].Nature,1979,280(5720):339-340.[4]CAPELB,SWAINA,NICOLISS,etal.Circulartranscriptsofthetestis-determininggeneSryinadultmousetestis[J].Cell,1993,73(5):1019-1030.[5]ABDELMOHSENK,PANDAAC,DES,etal.CircularRNAsinmonkeymuscle:age-dependentchanges[J].Aging(AlbanyNY),2021,7(11):903-910.[6]VENMT,HANSENTB,VENST,etal.Spatio-temporalregulationofcircularRNAexpressionduringporcineembryonicbraindevelopment[J].GenomeBiol,2021,16:245.[7]SALZMANJ,GAWADC,WANGPL,etal.CircularRNAsarethepredominanttranscriptisoformfromhundredsofhumangenesindiversecelltypes[J].PLoSOne,2020,7(2):e30733.[8]JECKWR,SORRENTINOJA,WANGK,etal.CircularRNAsareabundant,conserved,andassociatedwithALUrepeats[J].RNA,2020,19(2):141-157.[9]MEMCZAKS,JENSM,ELEFSINIOTIA,etal.CircularRNAsarealargeclassofanimalRNAswithregulatorypotency[J].Nature,2020,495(7441):333-338.[10]PETKOVICS,MULLERS.RNAcircularizationstrategiesinvivoandinvitro[J].NucleicAcidsRes,2021,43(4):2454-2465.[11]ZHANGXO,WANGHB,ZHANGY,etal.Complementarysequence-mediatedexoncircularization[J].Cell,2020,159(1):134-147.[12]ZAPHIROPOULOSPG.CircularRNAsfromtranscriptsoftheratcytochromeP4502C24gene:correlationwithexonskipping[J].ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(13):6536-6541.[13]刘军强,吴慧,朱诗琪,等.环状RNA的研究进展[J].江苏师范大学学报,2021,34(1):47-52.[14]RODRIGUEZ-TRELLESF,TARRIOR,AYALAFJ.Originsandevolutionofspliceosomalintrons[J].AnnuRevGenet,2006,40:47-76.[15]CHENI,CHENCY,CHUANGTJ.Biogenesis,identification,andfunctionofexoniccircularRNAs[J].WileyInterdiscipRevRNA,2021,6(5):563-579.[16]SCHWANHAUSSERB,BUSSED,LIN,etal.Globalquantificationofmammaliangeneexpressioncontrol[J].Nature,2018,473(7347):337-342.[17]TABAKHF,VANDERHORSTG,SMITJ,etal.DiscriminationbetweenRNAcirclesinterlockedRNAcirclesandlariatsusingtwo-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis[J].NucleicAcidsRes,1988,16(14A):6597-6605.[18]TRAYHURNP.NorthernBlotting[J].ProcNutrSoc,1996,55(1B):583-589.[19]KRYNDUSHKINDS,ALEXANDROVIM,TER-AVANESYANMD,etal.Yeast[PSI+]prionaggregatesareformedbysmallSup35polymersfragmentedbyHsp104[J].JBiolChem,2003,278(49):49636-49643.[20]SUZUKIH,ZUOY,WANGJ,etal.CharacterizationofRNaseR-digestedcellularRNAsourcethatconsistsoflariatandcircularRNAsfrompre-mRNAsplicing[J].NucleicAcidsRes,2006,34(8):e63.[21]HANSENTB,JENSENTI,CLAUSENBH,etal.NaturalRNAcirclesfunctionasefficientmicroRNAsponges[J].Nature,2020,495(7441):384-388.[22]WANGK,SINGHD,ZENGZ,etal.MapSplice:accuratemappingofRNA-seqreadsforsplicejunctiondiscovery[J].NucleicAcidsRes,2018,38(18):e178.[23]HOFFMANNS,OTTOC,DOOSEG,etal.Amulti-splitmappingalgorithmforcircularRNA,splicing,trans-splicingandfusiondetection[J].GenomeBiol,2020,15(2):R34.[24]SZABOL,MOREYR,PALPANTNJ,etal.Statisticallybasedsplicingdetectionrevealsneuralenrichmentandtissue-specificinductionofcircularRNAduringhumanfetaldevelopment[J].GenomeBiol,2021,16:126.[25]HANSENTB,WIKLUNDED,BRAMSENJB,etal.miRNA-dependentgenesilencinginvolvingAgo2-mediatedcleavageofacircularantisenseRNA[J].EMBOJ,2018,30(21):4414-4422.[26]GUOJU,AGARWALV,GUOH,etal.ExpandedidentificationandcharacterizationofmammaliancircularRNAs[J].GenomeBiol,2020,15(7):409.[27]LIZ,HUANGC,BAOC,etal.Exon-introncircularRNAsregulatetranscriptioninthenucleus[J].NatStructMol