环境生物技术讲座北大2

当前1页，总共68页。环境生物技术讲座北大当前2页，总共68页。

传统的基于微生物培养和纯种分离的技术在研究微生物生态、描述微生物群落的结构和多样性时存在诸多局限性，主要表现为：（1）对微生物类群进行描述之前必须首先进行培养，然而自然生境中的微生物，其大部分种类至今为止是不可培养的。（2）现有微生物分类标准具有主观性。即使某些新发现的微生物种可以被培养，但往往与现行的分类标准体系不相符，而已有的对各种微生物表型的描述也常常不能满足区分各种类群的需要。

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基于现代生物学的分子方法，为深入研究废水生物处理过程中各种微生物的作用，为深刻理解废水处理过程的本质、提高处理系统的性能以及进行工艺革新等提供了新的强有力的方法和手段，为我们了解这些处理系统中的微生物生态并对处理过程进行工程控制提供了可能。分子生物学方法的出现使我们有可能更好的理解现有的生物处理工艺（如活性污泥法、厌氧污泥消化）以及开发新的处理工艺。

当前4页，总共68页。利用分子生物学方法可以直接获得活性污泥中微生物种群的基因信息，可以为我们提供传统的测量指标，如生化需氧量（BOD）、挥发性悬浮固体（VSS）等所不能反映的一些精确信息。分子生物学方法可以跟踪活性污泥中一些关键性的微生物，如丝状菌、氨氧化菌等。我们将介绍常用的分子生物学方法在废水生物处理微生物学研究中的一些成果及最新进展，包括微生物的原位检测和定量分析、废水处理系统中微生物的多样性、与污泥膨胀和产生泡沫有关的细菌以及脱氮除磷微生物等。当前5页，总共68页。分子生物学方法可以直接探询微生物种群中我们感兴趣微生物的基因信息，而这些信息是传统的分析方法不可能获得的。利用分子生物学方法可以省去对微生物的选择培养以及利用形态特征进行鉴定微生物存在的偏差。本节主要内容1.1分子方法探询的基因目标1.2以rRNA为基因目标的优点1.3分子信息及其应用1分子生物学方法可以提供新的信息当前6页，总共68页。与建立在某些表型特性基础上的细胞富集培养方法不同，分子方法直接针对微生物群落的基因信息，分子技术测定的是细胞DNA或RNA的碱基序列。

分子方法以不同类型的DNA或RNA为目标，这取决于我们需要哪种信息。表1总结了检测目标以及每个目标能够提供的信息。1.1分子方法探询的基因目标当前7页，总共68页。目标获得的信息核糖体（r）RNA系统发育身份，它们是什么？DNA上编码rRNA的基因系统发育身份，它们是什么？DNA上的其他基因表型潜力，它们能够做什么？信使（m）RNA表型活性，它们正在做什么？蛋白质或其他报告产物表型活性或发育系统身份，它们是什么？或它们正在做什么？表1分子生物学方法探询的目标

当前8页，总共68页。为了确定群落中的微生物在系统发育上的身份，以rRNA（通常是16SrRNA）或用于编码rRNA的基因为分子检测的目标。表型潜力，如对某种特殊基质的降解能力，可以通过在DNA上寻找相关基因来进行检测。已经得到表达的表型潜力可以通过检测mRNA或蛋白质产物（如酶）来证明。根据我们的研究需要，可以利用适当的分子方法来探询表1给出的基因目标，从这些基因分析中我们可以得到所需的信息。基因探询的目标如图1所示。图1总结了微生物细胞如何将DNA中的遗传密码转录和翻译成蛋白质分子的机制。当前9页，总共68页。复制基因转录信使RNA蛋白质产物翻译氨基酸—转运RNA微生物细胞内的信息流动示意图DNA,mRNA,rRNA和蛋白质产物均可以作为分子方法探询的基因目标。

当前10页，总共68页。1.2以rRNA为基因目标的优点

核糖体RNA（rRNA）是目前用于构建生物系统发育树比较可靠的基因目标，可以为我们提供微生物群落中某一特定微生物丰度方面的信息。目前人们最常用的基因目标是rRNA，这是基于以下原因。当前11页，总共68页。（1）生物细胞需要rRNA将遗传信息翻译成蛋白质，因此，rRNA存在于所有的生物细胞中；（2）生物细胞内含有大量的核糖体，因此，rRNA相对来说容易检测到；（3）由于rRNA被包埋于核糖体中，因而相对较为稳定；（4）细菌和古细菌的小亚单位rRNA，即通常所说的16SrRNA，大约含1600个碱基对，这1600个碱基对可以提供足够的进化信息，从中选择15-20个碱基对序列的寡核苷酸片段用作探针，可以检测和鉴定多种微生物；（5）从环境样品中分离出rRNA并用于微生物系统发育、种类鉴定、多态性及多样性研究的方法已全面建立。利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法总结如图2。

当前12页，总共68页。利用rRNA序列研究微生物群落特征的方法

当前13页，总共68页。1.3分子信息及其应用

从图1可以看出，微生物细胞拥有一个复杂的信息流动网络，并用来决定其类型和控制其行为。这些信息在DNA中编码。DNA编码的基因并不实际承担任何细胞工作，如能量产生或合成。相反，它们通过精确的、多步骤机制解码DNA上的信息，并最终生成各种工作分子，如催化细胞内生化反应需要的酶。

当前14页，总共68页。目前常用的分子方法有:2.1核酸杂交2.2变性梯度凝胶电泳2.3限制性片段长度多态性2.4报告基因法2常用的分子生物学方法当前15页，总共68页。2.1核酸分子杂交技术探针是能与特定核苷酸序列发生特异性结合的己知碱基序列的核酸片段。它可以是长探针（100-1000bp），也可以是短核苷酸片段（10-50bp），可以是从RNA制备的cDNA探针，也可以是PCR产物或人工合成的寡核苷酸探针。探针既可用放射性核苷酸标记，也可用非放射性分子标记。核酸分子杂交的高度特异性以及检测方法的高度灵敏性，使核酸分子杂交技术广泛应用于检测环境中的微生物，并对它们的存在、分布、丰度和适应性等进行定性和定量分析。

当前16页，总共68页。

核酸杂交的主要步骤是核酸分子的变性和选择性退火。双链DNA或处于二级结构的RNA分子通过变性回复到它们原来的单链、线性形式，从而使它们处于能与互补的核苷酸链退火杂交的状态。杂交实验中所用到的核酸探针通常以需要检测的核酸序列为基础，它们可以来自DNA、RNA、寡核苷酸或cDNA等。当前17页，总共68页。核酸杂交以碱基配对原理为基础，利用寡核苷酸探针与靶细胞专一性结合进行生物分析。核酸杂交的基本实验步骤为：细胞固定、杂交（专一性和严格性依赖于杂交温度和时间、盐浓度、探针长度及其浓度）、洗脱（去除与靶细胞没有结合和非专一性结合的物质）和检测，如下图所示。当前18页，总共68页。核酸杂交的步骤

当前19页，总共68页。核酸杂交试验并不要求探针与目标核酸序列之间百分之百地互补。有限数目的非互补碱基对的存在是可以接受的。互补的单链核苷酸分子经退火形成核酸双链分子的过程是可逆的。因此，可以通过改变反应的物理和化学环境（条件）从而增加核酸双链分子生成的速度、程度及其稳定性。影响两段互补核苷酸链杂交的因素包括：杂交和洗膜的温度、杂交时间、离子强度、甲酰胺浓度、碱基对之间非互补的程度以及探针分子和靶核酸序列的长度、复杂性和浓度等。

当前20页，总共68页。利用核酸杂交技术研究环境样品中的微生物具有以下优点：（1）核酸可以直接从样品中提取，不必对微生物进行培养；（2）不管基因表达与否，都可以检测到特定的基因或核酸序列，从而能准确地跟踪、监测特定的微生物种群。通常，一份环境样品中可能只有一小部分的微生物类群在迅速生长，因而也只有一小部分的基因在活跃表达，在这种情况下，核酸杂交技术的这一优点更加明显；（3）利用同一样品可以同时检测到众多不同的微生物类群。实际上，核酸杂交的检测效率随着所分析的微生物类群的增加而提高；（4）由于可以直接检测到特定的核酸序列，因此该方法并不要求一定要有选择性表型（即突变衍生物），这就避免了野生种的生态适应性被营养缺陷型所抵消的问题。

当前21页，总共68页。当前22页，总共68页。

核酸杂交技术在环境中应用的一个重要局限就是它要比传统的方法复杂得多。（1）从各种环境样品中提取核酸本身就包含众多繁冗的抽提和纯化操作，因此也是最复杂的步骤之一。（2）从富含能干扰核酸检测的污染物的样品（如土壤）中回收核酸，仍有待用一些特殊的技巧对现行的有关方法加以改善。（3）对任何一个自然微生物群落的研究常常需要对其多个平行样品进行分析和统计，而目前要用核酸杂交技术分析如此众多的样品实际上相当困难。准确估算样品中有关基因的拷贝数的方法尚有待进一步建立。（4）从诸如水样等样品中检测到以很低丰度存在的、或在整个微生物群落中仅占很小比例的微生物类群，核酸杂交技术的灵敏度尚需大幅度提高。而要将特定的微生物或核酸序列从富含与它亲缘关系较近的其它微生物的背景中检测出来，也要求一些特殊的方法。

当前23页，总共68页。核酸杂交技术的一个缺点是只有对已被分离并已测序的微生物才能够放心使用。微生物生态学家估计在自然界中到目前为止，只有少数微生物能够被分离、培养。此外，被分离的微生物也可能并不能很好地代表自然环境中最重要的微生物。无论微生物是否已被分离或已完成测序，具有能提供微生物群落多样性指纹信息的分子技术是非常有用的。当前24页，总共68页。变性梯度凝胶电泳法（DGGE）是一种使用日益广泛的方法。在DGGE方法中，DNA在含聚丙烯酰胺凝胶电泳池的一端。电泳池两端的电极形成一个电场，吸引带负电的DNA向正极运动。DNA分子的移动速率取决于其分子大小与带电量之间的比值，因此，不同的DNA分子运动到两个电极之间的不同位置上停下，从而形成具有指纹作用的DNA带。将DNA带从凝胶中分离出来，可以进行进一步的扩增及测序。

2.2变性梯度凝胶电泳法（DGGE）当前25页，总共68页。DGGE法的原理如果不断增加温度或用化学变性剂处理，DNA双链分子的两条链就会开始分开（解链）。首先解链的区域由解链温度较低的碱基组成。G.C碱基对比A.T碱基对结合得要牢固，因此G.C含量高的区域具有较高的解链温度。同时影响解链温度的因素还有相邻碱基间的吸引力（称作“堆积”）。解链温度低的区域，通常位于端部，称作低温解链区（lowermeltingdomain）。如果端部分开，那么双螺旋就由未解链部分束在一起，这一区域便称作高温解链（highmeltingdomain）(下图)。如果温度或变性剂浓度继续升高，两条链就会完全分开。

当前26页，总共68页。当前27页，总共68页。当前28页，总共68页。限制性片段长度多态性（RFLP）分析是另一种指纹分析方法。该法利用限制性内切核酸酶将被扩增的DNA切成片段，限制性酶对DNA的剪切能避开靶基因区。靶基因周围的侧翼区中具有不同数目的酶切位点。因此，限制性酶切后得到的DNA片段的大小不同，能够通过电泳分离。

2.3限制性片段长度多态性（RFLP）当前29页，总共68页。报告基因法为评价已表达的表型潜力提供了另一条途径。在报告基因法中，利用重组技术将报告基因插入DNA分子上的目标区域。当DNA序列被转录时，报告基因也同时被转录。来自报告基因的mRNA被翻译成能催化某些易于检测的反应的酶。发光是最常见的报告基因效应，其中绿色荧光蛋白（GFP）最为常用。只有当完整序列被转录时才能观察到报告基因效应，因此，报告基因的表达意味着目标基因的表达。报告基因法可以对已表达的表型进行实时测定，其应用前景十分可观。2.4报告基因法当前30页，总共68页。GFP

绿色荧光蛋白作为新一代的基因转移报告物或定位标记物，在环境微生物研究中越来越受到关注，GFP的优点：（1）不需加任何底物，经激发后即可产生荧光，且荧光性质稳定；（2）相对分子质量小，对细胞无毒性；（3）检测方便，可对活细胞进行实时定位观察；（4）已有多种GFP突变蛋白，荧光特性得到明显改善。当前31页，总共68页。当前32页，总共68页。当前33页，总共68页。当前34页，总共68页。当前35页，总共68页。3.1活性污泥中微生物多样性研究3.2丝状细菌的研究3.3脱氮微生物的研究3.4除磷微生物的研究3分子方法的应用当前36页，总共68页。自1995年以来，基于16SrRNA基因库分析，人们对活性污泥和生物膜处理系统中微生物多样性进行了较广泛的研究。大量的16SrRNA基因序列研究表明，这些处理系统中最常出现的微生物主要有-、-和-Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria。这些发现与利用荧光原位杂交（FISH）研究活性污泥系统得出的结果一致。利用16SrRNA数据库还可以预测在所分析的系统中存在的细菌种属。尽管从废水处理反应器中得到的16SrRNA基因克隆非常多，但是，对于实际废水处理厂的微生物分析还没有足够的数据。

3.1活性污泥中微生物多样性的研究

当前37页，总共68页。此外，一些复杂系统中实际的微生物种群组成不能够仅仅根据16SrRNA基因库来推测，而必须根据定量FISH分析结果来确定。定量FISH方法还很少用于研究实际废水处理厂中微生物的种群结构，这可能是由于对不同探针标记的微生物在显微镜下进行计数非常费事，且技术上也有一些困难。半自动数字图像分析方法极大地加快了定量FISH的分析速度，并且使微生物学家第一次得到了活性污泥中微生物种群组成的高清晰度的、完整的图像。当前38页，总共68页。3.2

丝状细菌的研究

在活性污泥中存在一定数量的丝状菌对于污泥絮体的形成是重要的，但是，出现大量的丝状菌对于废水处理则是有害的，因为它们会导致在污泥中形成泡沫、或者使二沉池中活性污泥的沉降性变差（引起污泥膨胀）。许多丝状细菌难于培养，因此，人们对于丝状菌了解不多，目前仅有一些在显微镜下可以观察到的特征。据报道，人们在处理生活污水的废水处理厂观察到了30多种不同形态特征的丝状菌，在处理工业废水的活性污泥厂又观察到了约40多种其他形态特征的丝状菌。

当前39页，总共68页。利用透视电子显微镜（TEM）和定量FISH技术可以研究活性污泥中的丝状菌。利用显微操作技术富集和分离丝状微生物，然后进行16SrRNA基因序列分析。研究结果清楚地表明，一些分类学上相距较远的细菌通常具有在光学显微镜下难于分辨的相同形态特征。因此，对丝状菌根据其形态特征进行分类提出了强烈的置疑。在活性污泥中，有些丝状菌可以呈现出非丝状菌的生长形式。因此，仅仅根据形态特征进行鉴定有时是不可靠的。

当前40页，总共68页。基于丝状菌的16SrRNA基因序列，人们开发出了一套用于直接鉴定活性污泥中丝状菌的定向于rRNA的寡核苷酸探针。利用寡核苷酸探针和抗体染色技术，可以定量地研究活性污泥中丝状菌与污泥形成泡沫的关系。

当前41页，总共68页。当前42页，总共68页。当前43页，总共68页。当前44页，总共68页。改进丝状菌的原位鉴定和定量分析方法，开发丝状菌的有效控制技术，都需要进一步了解这些微生物生态生理方面的知识。

当前45页，总共68页。氨氮是生活污水中主要的含氮化合物（尿素极易水解形成氨），在污水处理厂中通过微生物的硝化和反硝化作用去除。尽管在教科书中仍然认为，Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterspp.是主要的氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌，但是，实际情况要复杂得多。

3.3

脱氮微生物的研究

当前46页，总共68页。氨氧化过程涉及的酶

NH4+

氧化为NO2-的过程需要经过2个步骤：

2H++NH4++2e-+O2NH2OH+H2O+2H+NH2OH+H2OHONO+4e-+4H+上述2个反应分别由氨单氧合酶（ammoniamonooxygenase，AMO）和羟胺氧化还原酶（hydroxylamineoxidoreductase，HAO）催化，其中AMO催化NH3

氧化为NH2OH的反应，HAO催化NH2OH氧化为NO2-的反应（见图）。在细胞内（invivo）和细胞外（invitro）进行的一系列研究使我们获得了关于AMO和HAO的结构与活性方面的大量信息。

当前47页，总共68页。氨氧化途径及其相关基因

当前48页，总共68页。氨单氧合酶（AMO）

AMO是一种细胞膜结合酶，类似于颗粒甲烷单氧合酶（pMMO）。许多间接证据表明，在N.europaea以及其它可能的Proteobacteria的L和Q亚类自养菌中，AMO包含3个亚单位，AMO-A,AMO-B和AMO-C，其结构和大小各不相同，位于细胞的细胞膜/壁膜间隙中。在含14C标记的14C2H2中培养N.europaea细胞时，AMO的活性会丧失，一个27-kDa的多肽（AmoA）被标记。因此，人们认为AmoA中有氧化NH3的催化位点。对N.europaea中编码氨单氧合酶的基因测序结果表明，第2个多肽（AmoB;38kDa）可以与AmoA一起纯化。关于AMO的第3个多肽（AmoC;31.4kDa）的信息是间接的。对Nitrosomonaseuropaea和Nitrosospirasp.NpAV中amoC，amoA,和amoB基因的转录研究结果表明，AmoC，AmoA和AmoB的基因一起转录到单链mRNA中。当前49页，总共68页。AMO除可以氧化NH3以外，还可以氧化一系列的底物，将C-H键氧化成醇，将C=C键氧化成环氧化合物。反应底物包括烷烃、芳烃、卤代烃等。这为生物修复受氯代烃污染的环境提供了一种新的途径。当前50页，总共68页。Nitrosomonas细胞内由AMO催化的几种反应

当前51页，总共68页。羟胺氧化还原酶（HAO）

羟胺氧化还原酶的结构非常复杂，该酶以溶解态位于壁膜间隙，但定位在胞质膜中，为64-kDa亚单位的同源三聚体，每一个亚单位包含8个c-型的血红素。其中7个血红素通过c-型的血红素典型的硫醚键与蛋白质共价结合。第8个血红素为P460，另外还有一个通过酪氨酸残基与蛋白质相连的共价键，位于NH2OH氧化的活性部位。HAO的晶体结构显示了每一个亚基中血红素的定向以及电子在酶中流动的潜在途径。当前52页，总共68页。在AMO催化的反应中，O2中的一个O原子插入NH3分子中，另一个O原子被还原成H2O，该反应需要2个额外的电子。因为NH3分子是这些细菌的唯一还原剂来源，所以生成H2O分子需要的电子必须来自NH2OH分子的随后氧化。在HAO催化氧化NH2OH分子过程中释放的4个电子中，2个电子流向NH3的氧化，剩下的2个电子用于其他的需要还原剂的细胞过程，如细胞生物合成和ATP的形成。当前53页，总共68页。酶功能的调节

氨氧化代谢产物NO2-对Nitrosomonaseuropaea

细胞中AMO活性的影响研究结果表明，NO2-对AMO活性有抑制作用，从而对Nitrosomonaseuropaea细胞产生毒性作用。Nitrosomonaseuropaea细胞中的亚硝酸盐还原酶（nitritereductase，NirK）并不是产生气体氮氧化物所必需的。借助于周质的含铜亚硝酸盐还原酶，微生物细胞可以克服NO2-产生的部分负面影响，提高微生物对NO2-的忍耐能力。NO2-可以刺激Nitrosomonaseuropaea细胞中的NH3氧化反应。氨限制会导致Nitrosomonaseuropaea细胞丧失AMO活性，但是，细胞的其他功能，如HAO活性保持不变。

当前54页，总共68页。在转录、翻译和后翻译水平上，氨对AMO活性的调节研究表明，利用RT-PCR，可以在相同的转录产物中检测出3种amo

基因的所以产物，这表明amoC

是amo操纵子的一部分。在Nitrosomonaseuropaea

细胞中，amo以及hao的转录受氨分子的诱导。但是在氨饥饿条件下，这些基因的mRNA在8小时内会消失。通过蛋白质印迹（westernblot）和酶活性测量等研究表明，在氨饥饿的Nitrosomonaseuropaea

细胞中，HAO可以保持稳定长达72小时。在自然界中，即使在氨浓度波动的条件下，氨氧化的2种关键酶，AMO和HAO，仍然可以保持稳定。当前55页，总共68页。氨氧化酶的基因

氨单氧合酶基因AMO的3个多肽由3个相邻的基因amoC，amoA

和amoB编码（图1）。在N.europaea

的基因组中，AMO在2个几乎相同的（>99%）拷贝中。其他的NH3-氧化细菌（如Nitrosomonascryotolerans，Nitrosococcusoceanus，Nitrosospirasp.NpAV）的amo基因与N.europaea的amo基因高度相似。在不同的NH3-氧化细菌中，基因蔟amoCAB出现在3个拷贝中。在生长的N.europaea细胞中可以检测出AMO的3个转录产物，分别对应于amoC，amoAB和

amoCAB

。关于AMOmRNAs的知识目前还不太了解，它们可能来自amoCABmRNA的加工，也可能来自amoC和amoA的转录。转录的起始位点在amoC起始密码子上游的166和103bp处，以及在amoC和amoA基因间区中amoA起始密码子上游114bp处。

当前56页，总共68页。羟胺氧化还原酶基因

编码羟胺氧化还原酶的基因hao，长度为1710bp，表达为单顺反子转录产物。该基因也编码18–24氨基酸前导序列，特别是周质蛋白质，它们在HAO的转运和成熟期间被去除。N.europaea的基因组包含3个分隔的HAO基因拷贝。除了在一个基因拷贝中有1个核苷酸差别外，hao基因3个拷贝的编码区域是相同的。当前57页，总共68页。用于氨氧化菌多样性分析的分子生物学方法是基于amoA基因（编码所有氨氧化细菌中氨单加氧酶亚单位的活性位点）和/或16SrRNA基因分析。200余个

amoA基因片断的比较序列分析结果显示，属于-Proteobacteria的各种氨氧化菌大量存在于废水处理厂的硝化活性污泥中，除N.europaea,Nitrosomonaseutropha,Nitrosococcusmobilis外，还有Nitrosomonasmarina等。amoA分析结果表明，与其它生态系统不一样，在这些硝化活性污泥中，Nitrosospira属的氨氧化菌并不重要。这些发现与氨氧化菌种群组成的定量FISH分析结果是一致的。当前58页，总共68页。值得注意的是，非生理活性的氨氧化菌也能够被FISH方法检测出，因为这些细菌即使在不利的环境条件下，细胞内也会有高含量的核糖体。利用MAR-FISH技术和14C同位素标记的碳酸氢盐作底物，可以精确地测定生理活性的氨氧化菌。最近，利用定量PCR技术和FISH技术，人们完成了氨氧化菌的分子工具箱。据此，可以推测出复杂样品，包括活性污泥中这些细菌的绝对细胞浓度。这些方法，如果与专一性合适的引物或探针结合，可以成为非常有价值的工具，用于确定废水处理厂设计和运行中的一些重要参数。当前59页，总共68页。分子生物学分析结果表明，在