生物统计与实验设计NNNSNP检测技术

内容简介1

SNP概念2

SNP特点3

SNP检测技术4

实验当前1页，总共59页。等位基因和基因型位于一对同源染色体的同一位置（基因型）上、控制相对性状的两个不同形式的基因叫等位基因。

一个基因由于突变（包括中性突变）可形成2个以上的等位基因，不同的等位基因可产生不同的遗传特征的变化，同时控制相对性状的显、隐性关系和遗传效应。如由突变形成的多种等位基因可产生多种异常表型。当前2页，总共59页。正常基因称为野生型基因：具有野生型基因的细胞或个体称为野生型（wildtype）。

基因突变（genemutation）：携带突变基因的各种类型的细胞或个体称为突变体或突变型（mutant）。当前3页，总共59页。一、SNP的概念单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。一般而言，SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。它包括单碱基的转换,颠换、插入及缺失等形式A/G、A/T、A/C、C/G、C/T和G/T转换的发生频率占多数当前4页，总共59页。二、SNP在基因组内的形式:一是遍布于基因组的大量单碱基变异;二是分布在基因编码区(codingregion),称其为cSNP，属功能性突变。

SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的：（1）非转录序列要多于转录序列（2）在转录区非同义突变的频率,比其他方式突变的频率低得多。当前5页，总共59页。三、SNP的特点在遗传学分析中,SNP作为一类遗传标记得以广泛应用,主要源于这几个特点:（1）密度高

SNP在人类基因组的平均密度估计为1\1000bp,在整个基因组的分布达3×106个,遗传距离为2～3cM,密度比微卫星标记更高,可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。（2）富有代表性某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此,它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。当前6页，总共59页。（3）遗传稳定性

与微卫星等重复序列多态性标记相比,SNP具有更高的遗传稳定性。（4）易实现分析的自动化

SNP标记在人群中只有两种等位型(allele)。这样在检测时只需一个“+\-”或“全\无”的方式，而无须象检测限制性片段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测量，这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。当前7页，总共59页。四、多态性与突变的区别1、多态性是一个群体概念，多态性指这个差异占群体的1%以上。否则就叫突变（小于1%）2、SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异只是单碱基。3、SNP一般来说，是全部体细胞一样的基因型（除开嵌合体）。4、突变一般不是一个个体全部细胞的变化。5、如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系。达到了1%就是多态性了。当前8页，总共59页。五、SNPs经典检测方法一大类是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法,如:1.限制性片段长度多态性法PCR-RFLP;2.单链构象多态性法PCR-SSCP;3.变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgeleletrophoresisDGGE);4.等位基因特异性PCR(allelespecificPCR,ASPCR)等等另一类，基因芯片、二代测序技术当前9页，总共59页。（一）PCR-RFLP方法

原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。特点：该技术应用的前提是SNP的位点必须含有该限制内切酶的识别位点，它是SNP筛查中最经典的方法之一.当前10页，总共59页。PCR-RFLP原理图当前11页，总共59页。（二）单链构象多态性(SSCP)

原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位置。当前12页，总共59页。当前13页，总共59页。（三）变性梯度凝胶电泳（DGGE）原理：是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。电泳开始时,DNA在胶中的迁移速率仅与分子大小有关,而一旦DNA泳动到某一点时,即到达该DNA变性浓度位置时,使得DNA双链开始分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电场力平衡时,DNA片段在凝胶中基本停止迁移。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异,使得其变性条件产生差异,从而在凝胶上形成不同的条带。当前14页，总共59页。当前15页，总共59页。（四）等位基因特异PCR(AS-PCR)原理：根据SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3′末端与SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的SNP。当前16页，总共59页。当前17页，总共59页。PCR条件优化TaqDNA聚合酶：1-5U/100ul,浓度过高-非特异扩增，过低-产量不足。dNTP:20-200μmol/L,四种浓度要相等，任何一种不等都会发生错配。Mg++浓度：0.5-2.5mmol/L,一般反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为为宜，过高-非特异性，过低-酶活性降低。引物浓度：μmol/L,过高—错配、特异扩增，二聚体当前18页，总共59页。模版浓度、质量100-200ng/100ul偏向性扩增的解决所谓偏向性扩增是因为SNP位点上会往往存在嘌吟和嘧啶的替换，在PCR过程中，聚合反应对嘧啶(C或T)比较敏感，使得嘌吟(A或T)的扩增非常少，而出现偏向性扩增，这在SNP位点附近嘌吟含量较高时特别明显。解决方案：（1）PCR扩增循环保持一个绝对低的水平；（2）在样本中加入0.1NNaOH使DNA变性为单链，经中和后加入全基因组扩增试剂。（3）巢式PCR-RFLP”基因分型技术当前19页，总共59页。AAAAGGAAGATCCCAATTTTCCTTCTAGGGTTAAAAGTAAGATCCCAATTTTCATTCTAGGGTT当前20页，总共59页。QIAGENREPLI-g试剂盒当前21页，总共59页。PCR反应出现的问题与对策1、假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染当前22页，总共59页。解决方法：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。当前23页，总共59页。2、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。当前24页，总共59页。对策：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。当前25页，总共59页。3、出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。当前26页，总共59页。优点：这个方法是最便宜的，不需要酶切，一次PCR就可以得到GENOTYPING的信息。缺点：PCR对于3'端的特异性在不同退火温度时有出入，所以退火温度的摸索很关键，否则假阳性扩增是很容易的。另外，内参照的设置也很重要，这个东西还是很有意思的。而且，所使用的引物位置无法人为调整，只能放在SNP的5'段。当前27页，总共59页。其基本原理是利用PCR引物的3’端，对SNP位点附近的碱基进行人为改造，产生一个常规的限制性内切酶识别序列，如SNPrs1321425（rs1321425－来自NCBI的refSNP数据库）的C/G，其任何一个碱基和上下游碱基无法形成一个可直接被限制性内切酶识别的序列，于是对SNP位点前的上游碱基进行改造，（五）巢式PCR-RFLP技术当前28页，总共59页。NestedPCR原理示意图FirstPCRSecondPCR当前29页，总共59页。通过对序列的分析和PCR效果的计算，将原本四个碱基AGAT改成CTGC，结合后一个碱基A以及SNP位点G，形成CTGCAG（PstI）酶切识别位点，经测序和序列对比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的将2个碱基，3个碱基进行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATAC/GACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCACTTCTGTAAACTACATGCACTAAT当前30页，总共59页。（六）杂交+荧光共振分子信标（双分子间杂交）蝎状探针（分子内杂交）31当前31页，总共59页。1、分子信标（Molecularbeacons）分子信标是一种新型的发卡结构的寡核苷酸探针,是在样品PCR过程中因和样品DNA杂交后而使自身荧光构象改变从而实现对SNP的检测(原理见图1)。分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop)的两部分构成,茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形成的,又可称之为手臂,环则是探针的中间部分,其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP

位点。在手臂的两个末端分别通过共价的方式结合上一个荧光分子和一个荧光猝灭基团,这样当分子信标游离在溶液时,它当前32页，总共59页。以发卡结构存在,荧光分子与猝灭基团在空间距离上挨在一起,十分接近,荧光分子被猝灭,此时溶液无荧光信号。相反当分子信标和其完全互补的目的片段杂交时,其发卡结构被拉开而使荧光分子和荧光猝灭基团在空间上分开从而发射出荧光,其信号可提高900倍。特异性很高,相差一个碱基的目的片段都能够区分,因此用于SNP位点的检测,同时我们可以对分子信标标记以不同的荧光信号,从而能够对多个样品的同时检测。由于分子信标是在样品PCR过程中的退火时期和目的片段特异性杂交,释放荧光,某一循环或循环后的荧光量取决于那时形成的特异的PCR产物,因此也用于PCR产物产量的实时检测。当前33页，总共59页。当前34页，总共59页。2、蝎状探针（Scorpionprimer）35当前35页，总共59页。Scorpionprimer是由发卡结构(hairpinloop)的探针部分，通过一段称为PCRstopper(orPCRblocker)的寡核苷酸和PCR引物的5′端相连构成。探针部分的结构和Molecularbeacons类似,由互补序列构成的“茎”和包含SNP位点且和待检测目的片段。当前36页，总共59页。而PCRstopper的作用是在PCR过程中阻止对探针部分的扩增,避免发卡状结构在无待检测片段时通过扩增被打开而产生错误的荧光信号。在对样品进行检测时以Scorpionprimer作为PCR扩增的引物,当其以样品DNA作为模板延伸后,Scorpionprimer中的探针部分就可以和同一条DNA链上的互补部分杂交,而导致自身构象的改变释放出荧光信号互补的“环”构成,荧光分子和猝灭基团分结合在茎的末端,当前37页，总共59页。当前38页，总共59页。

（七）SNPs高通量的检测方法

另一大类检测方法是近些年来发展起来的,高通量、自动化程度较高的检测SNPs的方法,较为常用的有:1.DNA测序法;2.DNA芯片检测;3.飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测;4.变性高效液相色谱(DHPLC)法等等当前39页，总共59页。1、DNA测序法直接测序是最容易实施的SNP检测方法。原理:

通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率可达100%。特点：可以得到SNP的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。当前40页，总共59页。2、基因芯片技术(Genechips)

原理:是将具有特定碱基序列的探针固定在特殊的载体上，待测基因经提取、荧光标记后，与固定好的探针进行杂交，最后根据荧光的强度和种类测出待测序列的碱基类别。

特点：基因芯片具有信息量大和自动化程度高的突出优点。但它也存在若干问题:芯片造价高昂,所需设备贵重,不利于普及应用。当前41页，总共59页。3、飞行质谱仪MALDI-TOF

原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合物共价结合后,在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪上显示不同峰而检测SNP。当前42页，总共59页。4、变性高效液相色谱(DHPLC)原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后，含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来,从而达到分离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突变的碱基。特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高，便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95%以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高,容易产生误差,不能检测出纯合突变。当前43页，总共59页。5、MassARRAYSNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱技术相结合，实现基因分型检测。基于MassARRAY®

分子量阵列平台的iPLEXGOLD技术可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。当前44页，总共59页。当前45页，总共59页。当前46页，总共59页。当前47