免疫自动化仪器分析

免疫自动化仪器分析第一页，共五十五页，2022年，8月28日概论早期免疫分析通过观察沉淀物形成，凝集及溶血现象发生来分析，如免疫扩散、免疫电泳、血凝试验、补体结合等上世纪50年代末60年代初，利用AG-AB复合物形成使浊度改变，再用比浊计来比浊，但因其敏感性差未被接受70年代初，开始有自动检测系统，但因其用的是激光为光源，固定波长，灵敏度较低，而且时间一般要2—3小时第二页，共五十五页，2022年，8月28日概论70年代未，速率比浊计的出现，使抗原抗体结合的反应在几十秒内出结果，可以说是免疫化学测定的革命的发展随着标记技术的发展，免疫化学可以纳入临床化学检验范畴如今，自动化免疫分析系统更加飞速发展自动化免疫分析的基础是抗原抗体的结合，具有高特异性；手段多是利用标记技术而将检测信号放大，具有高灵敏度第三页，共五十五页，2022年，8月28日自动化免疫仪器种类（应用技术）免疫比浊分析技术化学发光、电发光分析技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术酶免疫分析技术流式细胞术第四页，共五十五页，2022年，8月28日免疫比浊利用抗原抗体结合后溶液的浊度变化而检测的一种方法此法准确快速，已成为免疫诊断技术中重要的检测手段比浊法与比色法第五页，共五十五页，2022年，8月28日散射免疫比浊分析法

基本原理：抗原抗体复合物对一定波长的光产生折射、偏转，偏转角度及散射光强度与复合物粒子的大小和量有关（图）Rayleigh散射（图）Mile散射Heidelberger曲线第六页，共五十五页，2022年，8月28日定时散射比浊分析基本原理：免疫沉淀反应和散射比浊分析结合之技术，反应分两个阶段，预反应阶段和反应阶段（图）保证抗原不过量的方法：确保反应体系抗体过量对抗原过量进行阈值限定第七页，共五十五页，2022年，8月28日预反应阶段5ul样本抗原过剩区阈值信号反应阶段45ul样本7.5秒2分钟6分钟（2+4分钟）定时散射比浊反应曲线图抗原不过量抗原过量第八页，共五十五页，2022年，8月28日速率散射比浊分析基本原理：抗原抗体结合反应的一种动态测定法，适时检测抗原抗体复合物形成的散射光信号最快反应时间（图）抗原过量检测（图）第九页，共五十五页，2022年，8月28日抗原浓度递增散射光峰值峰值信号与抗原抗体反应之间的关系图ABCDFGHI第十页，共五十五页，2022年，8月28日反应时间（秒）06085散射率抗体过量抗原过量第二峰值信号抗原量检测速率峰值信号产生第十一页，共五十五页，2022年，8月28日免疫透射比浊基本原理：检测信号是通过溶液的光，测量角度与正前方夹角为0℃（图），保持抗体过量，形成可溶性AG-AB复合物，使介质浊度发生改变。实验要求：选择亲和力高的抗体，抗原抗体复合物要大、数量要多，反应时间充分。第十二页，共五十五页，2022年，8月28日单色器透射比浊计散射比浊计散射比浊和透射比浊的区别示意图θ透射光散射光散射光第十三页，共五十五页，2022年，8月28日胶乳浊度测定法基本原理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比（图）第十四页，共五十五页，2022年，8月28日λ光波胶乳浊度测定法原理dd<λ<2d第十五页，共五十五页，2022年，8月28日影响免疫比浊的因素

抗原抗体比例抗体纯度和效价增聚剂（PEG）第十六页，共五十五页，2022年，8月28日自动免疫浊度分析仪的要求校准程序，使仪器处于正常的工作状态定标程序，保证检测结果的准确性自动控制，保证实施实验条件中的抗原抗体反应体系要求自动系统，障碍的检测和预警。第十七页，共五十五页，2022年，8月28日自动化免疫仪器种类（应用技术）免疫比浊分析技术化学发光、电发光分析技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术酶免疫分析技术流式细胞术第十八页，共五十五页，2022年，8月28日化学发光自动免疫分析化学发光是指在化学反应过程中产生光的发射现象基本原理：标记在抗原或抗体上的发光物质在碱性介质中氧化时产生激发态的中间体，中间体回基态时产生辐射，多余的能量为发射光子，产生发光现象，再对光信号进行接收转化，可得检测物浓度发光物质须具备：氧化致发光、光量子产额高、理化性能好第十九页，共五十五页，2022年，8月28日化学发光自动免疫分析类型化学发光免疫分析（CLIA）是一种用发光剂直接标记抗体的一类免疫分析法，用来标记的发光物必须能参与发光反应、标记和偶联后能稳定、理化性质和免疫特性不改变，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。

第二十页，共五十五页，2022年，8月28日化学发光自动免疫分析类型化学发光酶免疫分析（CLEIA）以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。发光信号与抗原抗体的量成正比。多用的发光体系是HRP-鲁米诺。

第二十一页，共五十五页，2022年，8月28日化学发光自动免疫分析类型微粒子化学发光免疫分析（ECIA）也是一种酶免疫分析，用磁珠作为固相载体，增加反应体积和分离效率。标记的酶多为ALP。第二十二页，共五十五页，2022年，8月28日化学发光自动免疫分析类型电化学发光免疫分析（ECLIA）一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程,其中应用了“亲和素-生物素”放大系统，使检测的灵敏度大大提高以双抗体夹心法为例之图示（图）第二十三页，共五十五页，2022年，8月28日ECLIA体系结构图第二十四页，共五十五页，2022年，8月28日ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）第二十五页，共五十五页，2022年，8月28日ECLIA检测流程图二（生物素与亲和素结合）第二十六页，共五十五页，2022年，8月28日ECLIA检测流程图三（磁珠吸引吸附于电极表面）第二十七页，共五十五页，2022年，8月28日ECLIA检测流程图四（电极充电启动电化学反应）第二十八页，共五十五页，2022年，8月28日ECLIA检测流程图五（撤消磁场冲洗磁珠）第二十九页，共五十五页，2022年，8月28日化学发光自动免疫分析化学发光免疫分析是免疫技术、发光技术和计算机系统的结合，具有特异性强、灵敏度高（pg/ml)、精密度好、准确度好等特点，越来越多的人体微量指标应用这种方法来检测，已渐渐代替了RIA。第三十页，共五十五页，2022年，8月28日自动化免疫仪器种类（应用技术）免疫比浊分析技术化学发光、电发光分析技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术酶免疫分析技术流式细胞术第三十一页，共五十五页，2022年，8月28日荧光免疫自动化利用荧光物质标记抗原抗体的一种检测方法由免疫反应、荧光及计算机技术联合应用的技术主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定第三十二页，共五十五页，2022年，8月28日荧光免疫自动化时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）：AG-AB结合，某些荧光物质发长寿命荧光，时间分辨技术利用长寿命荧光物质（镧氏元素铕螯合物）标记抗原或抗体，测定过程中，可利用延迟时间来消除非特异性的荧光干扰（图）。第三十三页，共五十五页，2022年，8月28日光强度激发短寿命荧光长寿命荧光延迟时间测量时间铕螯合物的激发、发射光谱第三十四页，共五十五页，2022年，8月28日荧光免疫自动化TRFIA设计中的一些注意事项：Stakes位移（图）解离增强第三十五页，共五十五页，2022年，8月28日荧光免疫自动化荧光偏振免疫测定：以小分子物质与大分子物质的旋转差异而使它们对偏振光的吸收不同为依据检测小分子药物荧光酶免疫分析：标记酶参与反应第三十六页，共五十五页，2022年，8月28日波长300400500600700Stakes吸光度Stakes位移示意图激发光荧光第三十七页，共五十五页，2022年，8月28日自动化免疫仪器种类（应用技术）免疫比浊分析技术化学发光、电发光分析技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术酶免疫分析技术流式细胞术第三十八页，共五十五页，2022年，8月28日流式细胞仪流式细胞仪（FCM）是以激光为光源，检测生物学颗粒理化性质的仪器生物学颗粒包括免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细胞、染色体、真核细胞等理化性质则为细胞大小、形状、胞浆颗粒、DNA含量、酶活性等第三十九页，共五十五页，2022年，8月28日流式细胞仪FCM综合了激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学及计算机技术，被称为实验室“CT”FCM现正广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、病理学、遗传学、临床检验学等第四十页，共五十五页，2022年，8月28日流式细胞仪基本原理基本原理：单个经荧光染料染色的细胞经过激光激发后，发射的荧光在不同的角度进行测量，并对其信号进行综合分析（图）细胞分选原理：通过测量区的细胞若其参数符合实验设计的条件，在经过偏转板时被充上相应的电荷并被偏转收集（图）第四十一页，共五十五页，2022年，8月28日第四十二页，共五十五页，2022年，8月28日第四十三页，共五十五页，2022年，8月28日液流系统：样本和鞘流液组成（图）光学系统：光源可为汞灯或激光信号接收系统：散射光和荧光的检测流式细胞仪基本组成第四十四页，共五十五页，2022年，8月28日侧向荧光信号鞘流前向散射光流式细胞流动池示意图喷嘴激光束第四十五页，共五十五页，2022年，8月28日散射光的检测信号的产生及强度（图）前向散射光（图）侧向散射光（图）第四十六页，共五十五页，2022年，8月28日信号的产生激光照射区信号检测曲线第四十七页，共五十五页，2022年，8月28日细胞中荧光素今量与信号的关系信号的产生第四十八页，共五十五页，2022年，8月28日细胞中荧光素今量与信号的关系信号的产生第四十九页，共五十五页，2022年，8月28日激光器激光器激光探测器大颗粒小颗粒前散射光示意图第五十页，共五十五页，2022年，8月28日激光器激光器侧向散射光探测器复杂颗粒简单颗粒侧向散射光示意图第五十一页，共五十五页，2022年，8月28日荧光测量荧光染料染色的细胞通过测量区时，细胞中特异性荧光物质受激发产生荧光信号，后者强弱表示待测物质的多少荧光的检测系统由滤光片和检测器组成，滤光片的作用是使激发光波长尽可能接近荧光染料的激发光谱峰值，滤除非荧光信号，提高荧光的检测强度第五十二页，共五十五页，2022年，8月28日流式细胞仪免疫分析的技术要求仪器性能指标：荧光分辨率、荧光灵敏度、前向角散色光灵敏度、前向角散光分辨率、分析/分选速度、分选纯度、分选收获率检测样品要求要单细胞悬液荧光