沙门氏菌的检测

沙门氏菌的检测授课教师：汪清美当前1页，总共44页。一、实验目的1.掌握沙门氏菌属的检测方法2.了解沙门氏菌的基本生化反应及原理当前2页，总共44页。二、实验器材1.菌种：沙门氏菌、大肠杆菌2.检样：鲜鸡蛋3.培养基：四硫磺酸钠黄绿（TTB）增菌液；氯化镁孔雀绿增菌液（MM)；亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液；亚硫酸铋（BS）琼脂；HE琼脂；SS琼脂；三塘铁琼脂（TSI）4.设备：冰箱、恒温培养箱、均质器、振荡器、电子天平、无菌锥形瓶、无菌吸管、无菌培养皿、无菌试管、无菌毛细管当前3页，总共44页。1.四硫磺酸钠黄绿（TTB）增菌液基础液900mL硫代硫酸钠溶液100mL碘溶液20.0mL煌绿水溶液2.0mL牛胆盐溶液50.0mL临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。当前4页，总共44页。蛋白胨10.0g

蒸馏水1000mLpH7.0±0.2

牛肉膏5.0g氯化钠3.0g碳酸钙45.0g（碳酸钙可以调节ph,是培养基在养菌过程中维持一定ph,否则ph过低,影响菌株生长另外还有筛选产酸菌的作用）除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌121℃，20min基础液当前5页，总共44页。硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0g蒸馏水加至100mL高压灭菌121℃，20min。（硫代硫酸钠作为中和剂，可以灭菌121,15min，没有影响的，检验含有次氯酸钠的消毒水微生物，需要加入1.5%硫代硫酸钠溶液；培养基中硫代硫酸钠和磺所生成的四硫磺酸，能抑制大部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与副伤寒沙门氏菌仍能生长，因为沙门氏菌具有四硫磺酶，能分解四硫磺酶。）当前6页，总共44页。

ＴＴＢ培养基使用方法和注意事项

1.使用方法：称取本品93.55g，溶解于1050ml蒸馏水中，加热溶解，临用前加入20％碘液20ml,0.5g煌绿2ml。2.注意事项：ＴＴＢ培养基不加碘液可在4-10度冰箱保存。加入碘液后必须在几小时内使用。培养基中有白色碳酸钙沉淀为正常现象。当前7页，总共44页。3.原理：四硫酸钠是由硫代硫酸钠和碘经氧化生成而来，它对大肠菌群有抑制作用，对沙门氏菌无影响。因沙门氏菌具有四硫磺酸酶，能分解四硫磺酸钠，而大肠菌群没有这种酶，故生长受抑制。碳酸钙为缓冲剂，可使沙门氏菌不致因酸碱度改变而死亡。当前8页，总共44页。2.氯化镁孔雀绿增菌液（MM)甲液：胰蛋白胨5g；磷酸二氢钾1.6g；氯化钠8g蒸馏水1000ml；2.乙液：氯化镁40g；蒸馏水100ml3.丙液：0.4%孔雀绿水溶液4.制法:上述成分配好后，121度高压灭菌15min，临用时取甲液90ml；乙液9ml丙液0.9ml当前9页，总共44页。MM增菌液各成分的作用胰蛋白胨提供氮源和碳源满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；磷酸二氢钾是缓冲剂；氯化镁可以增加培养基的渗透压；孔雀绿抑制非沙门氏菌的生长，较低的pH结合氯化镁和孔雀绿使培养基具有较高的选择性。当前10页，总共44页。3.亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液成分蛋白胨5.0g

乳糖4.0g

磷酸氢二钠10.0g亚硒酸氢钠4.0g

L-胱氨酸0.01g

蒸馏水1000mLpH7.0±0.2制法除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10mL（称取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至100mL即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。当前11页，总共44页。SC增菌液各成分的作用蛋白胨提供碳源满足细菌生长的需求，乳糖是可发酵的糖类；亚硒酸氢钠抑制革兰氏阳性菌和非沙门氏菌的大多数革兰氏阴性菌的生长，磷酸盐是缓冲剂，L-胱氨酸为还原剂。当前12页，总共44页。4.亚硫酸铋（BS）琼脂蛋白胨10.0g

牛肉膏5.0g

葡萄糖5.0g硫酸亚铁0.3g

磷酸氢二钠4.0g煌绿0.025g或5.0g／L水溶液5.0mL柠檬酸铋铵2.0g

亚硫酸钠6.0g琼脂18.0g～20g

蒸馏水1000mL

pH7.5±0.2当前13页，总共44页。将前三种成分加入300mL蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中，琼脂加入600mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃～55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。制法当前14页，总共44页。BS培养基的原理1.蛋白胨、牛肉膏粉提供碳源和氮源；2.葡萄糖提供能源3.亚硫酸铋抑制剂，抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群，但不影响沙门氏菌的生长；4.磷酸氢二钠缓冲剂5.硫酸亚铁用于产生硫化氢，并与铁反应生成黑色沉淀，使阳性培养物在平板上具有金属光泽的棕色或黑色菌落6.琼脂是凝固剂当前15页，总共44页。5.HE琼脂基础成分：蛋白胨12.0g

牛肉膏3.0g

乳糖12.0g

蔗糖12.0g水杨素2.0g

胆盐20.0g

氯化钠5.0g

琼脂18.0g～20.0g蒸馏水1000mL

0.4％溴麝香草酚蓝溶液16.0mLAndrade指示剂20.0mL甲液20.0mL

乙液20.0mL

pH7.5±0.2当前16页，总共44页。②甲液的配制硫代硫酸钠34.0g

柠檬酸铁铵4.0g

蒸馏水100mL③乙液的配制去氧胆酸钠10.0g蒸馏水100mL④Andrade指示剂

酸性复红0.5g

1mol/L氢氧化钠溶液

16.0mL

蒸馏水100mL，将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1mL～2mL。当前17页，总共44页。

制法将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内，调节pH。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至50℃～55℃倾注平皿。注:①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。当前18页，总共44页。.HE琼脂的原理蛋白胨、牛肉膏粉提供碳源、氮源、维生素和矿物质乳糖、蔗糖和水杨素为可发酵的糖类胆盐、去氧胆酸钠抑制革兰氏阳性菌氯化钠维持均衡的渗透压硫代硫酸钠和柠檬酸铁铵用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色琼脂是培养基的凝固剂溴麝香酚蓝和酸性复红为PH指示剂发酵糖产酸的菌落呈红色，不发酵糖的菌落为蓝绿色当前19页，总共44页。6.SS琼脂配方

牛肉粉月示胨乳糖三号胆盐枸橼酸钠硫代硫酸钠枸橼酸铁中性红煌绿琼脂pH值7.0±0.1

5.05.0010.08.58.58.51.00.0250.0003317.0当前20页，总共44页。月示胨、牛肉粉提供碳源、氮源、维生素和矿物质；乳糖、葡萄糖为可发酵的糖类；三号胆盐、枸橼酸钠和煌绿抑制革兰氏阳性菌及大多数的大肠菌群和变形杆菌，但不影响沙门氏菌的生长；硫代硫酸钠和枸橼酸铁用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色；中性红为pH指示剂，可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌鉴别开，前者为红色菌落，后者为无色菌落发酵糖产酸的菌落呈红色，不发酵糖的菌落为无色；琼脂是培养基的凝固剂。SS琼脂的原理当前21页，总共44页。1.前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的沙门菌恢复活力;2.选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，大多数其它细菌受到抑制;3.选择性平板分离培养：分离出所需的细菌;4.生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合所检项目的细菌;5.血清学鉴定：进一步鉴定。1.基本步骤（程序）：当前22页，总共44页。加工过的样品：称取25g（mL）样品放入盛有225mL缓冲蛋白胨水（BPW）的无菌均质杯，以8000～10000r/min均质1~2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋，拍击式均质拍打1~2min。液体样品不需均质，振摇混匀。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中（如使用均质袋，可直接培养），36±1℃培养8～18h。冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃~5℃不超过18h解冻。未加工样品：。。。。。（1）前增菌当前23页，总共44页。

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mL四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液内，42℃±1℃培养18～24h。同时，另取1mL，转种于10mL亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液内，36±1℃培养18～24h。SC更适合伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌增菌，最适增菌温度为36℃±1℃，时间为18—24h。TTB更适合其他沙门氏菌增菌，最适增菌温度为42℃±1℃，时间为18—24h。增菌时，必须同时使用SC和TTB，提高检出率，以防漏检。（2）增菌当前24页，总共44页。（3）分离---选择性平板分离分别用接种环取增菌液一环，划线接种于选择性培养基上，分离培养一个亚硫酸铋（BS）琼脂平板，36±1℃培养40～48h一个木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基），36±1℃培养18～24h。观察各平板上生长的菌落，各平板上的菌落的特征见附表。当前25页，总共44页。当前26页，总共44页。SS琼脂平板

当前27页，总共44页。

当前28页，总共44页。BS琼脂当前29页，总共44页。BS上的菌落DHL上的菌落SS上的菌落当前30页，总共44页。BS＋

XLDHE科玛嘉显色培养基平板一种培养基不可能适合所有沙门氏菌的分离，BS选择性强，更适合分离伤寒沙门氏菌。分离沙门氏菌要同时用两种以上的培养基，互补，可提高检出率，以防漏检。其中必须有BS。当前31页，总共44页。（4）生化试验选择性琼脂平板上符合沙门氏菌特征的菌落，只能称其疑为沙门氏菌，也可能是其他杂菌。五项生化试验：三糖铁(TSI)试验赖氨酸脱羧酶试验靛基质试验尿素琼脂培养氰化钾培养基当前32页，总共44页。1.三糖铁(TSI)试验自选择性琼脂平板上分别挑取两个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再底层穿刺，用一空白培养基作对照试验。2赖氨酸脱羧酶试验：接种三糖铁琼脂的接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h。当前33页，总共44页。三糖铁（TSI）琼脂试验培养基：乳糖：蔗糖：葡萄糖=10：10：1；加有酚红本试验可同时观察糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。原理：只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。34当前34页，总共44页。三糖铁(TSI)试验测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解和产硫化氢情况:不分解乳糖、蔗糖，分解葡萄糖√√不产酸，碱性粉红色（-）；产酸黄色（+）；产生H2S黑色（+）；不产生H2S（-）

。当前35页，总共44页。思考题1.志贺菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多数不发酵乳糖，不产生硫化氢，应该是几号？2.大肠杆菌，能分解葡萄糖，产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生硫化氢，应该是几号管？3.沙门氏菌能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生硫化氢，多说产气，应该是几号管？当前36页，总共44页。赖氨酸脱羧酶试验(1)原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳。胺使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。

(2)方法：将待检菌分别接种于1支赖氨酸脱羧酶试验管和1支对照管，各覆盖至少0.5cm高度的无菌石蜡油，35℃孵育1~4d，观察结果。(3)结果：若为溴甲酚紫指示剂，阳性试验管培养初期（10—12h）因发酵葡萄糖产酸变黄，继续培养由于氨基酸脱羧产生胺类而使培养基由酸变碱，故又由黄变为紫色。阴性试验管则始终呈黄色。对照管应为黄色。当前37页，总共44页。38当前38页，总共44页。3进一步生化试验：接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基及对照培养基各1管。于36±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h

当前