分子标记及应用

分子标记及应用第一页，共四十七页，2022年，8月28日主要内容一、背景知识二、分子标记及其应用博诚第二页，共四十七页，2022年，8月28日背景知识

遗传—通过细胞染色体（DNA）由祖先向后代传递的品质。

基因表达—指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。背景知识博诚第三页，共四十七页，2022年，8月28日

变异—指生物体子代与亲代之间的差异，子代个体之间的差异的现象。变异分为可遗传变异与不可遗传变异。前者是由于环境变化而造成，不会遗传给后代，如由于水肥不足而造成的植株瘦弱矮小；后一变异是由于遗传物质的改变所致。背景知识博诚第四页，共四十七页，2022年，8月28日

遗传多样性—种内不同种群之间或同一种群内不同个体的遗传变异总和。遗传多样性可以表现在多个层次上，如分子、细胞、个体等。第五页，共四十七页，2022年，8月28日分子标记？

所谓“标记”，是指“便于识别的标识或者记号”。分子标记的本质是便于识别的特异性DNA片段，能够识别生物个体或种群间基因组中某种差异，直接反映了DNA水平的遗传多态性。分子标记

在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析。现在分子标记技术已有数十种，应用广泛。

博诚第六页，共四十七页，2022年，8月28日分子标记主要技术1）RFLP:限制性片段长度多态性2）RAPD:随机扩增多态性DNA3）AFLP:扩增片段长度多态性4）MLPA:多重连接探针扩增技术5）VNTR:数目可变串联重复多态性6）STR:简单重复序列或微卫星标记7）SNP:单核苷酸多态性8)SSCP:单链构象多态性分子标记博诚第七页，共四十七页，2022年，8月28日

限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。用于分析相关基因多态性的技术。即用同一种限制性内切酶，酶切来源于同一物种不同个体的基因组DNA，从而获得长度各异的DNA片段。1、限制性片段多态性分析—RFLP分子标记博诚第八页，共四十七页，2022年，8月28日分子标记流程：酶切电泳标记探针杂交转移至膜分析显色第九页，共四十七页，2022年，8月28日RFLP技术特点1、分析所需DNA量较大，2、步骤较多，周期长，3、制备探针及检测中要用到放射性同位素缺点2、是一种共显性标记，可区分纯合体与杂合体。优点1、结果稳定，重复性好。分子标记博诚第十页，共四十七页，2022年，8月28日1、遗传多样性的研究 2、构建遗传图谱3、标定基因4、分子水平上选择目的性状5、对作物数量性状基因进行定位6、进行品种或品系遗传纯度的测定应用品种鉴定作物遗传育种这种技术可以用于遗传指纹和亲子鉴定

分子标记博诚第十一页，共四十七页，2022年，8月28日2、随机扩增多态性DNA技术—RAPD

随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD)以单一的随机引物(一般为10个碱基)利用PCR技术随机扩增未知序列的基因组DNA获得的DNA片段长度变异。它是利用随机引物通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。分子标记博诚第十二页，共四十七页，2022年，8月28日RAPD标记分子标记博诚PCR电泳显色分析随机引物试验步骤：第十三页，共四十七页，2022年，8月28日RAPD的优点：无种属特异性适合于自动化分析不需制备探针、杂交等程序，成本较低。DNA用量少，允许快速、简单地分离基因组DNA。RAPD缺点：是一种显性标记稳定性较差分子标记博诚RAPD技术特点第十四页，共四十七页，2022年，8月28日RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。1、品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族、种内或种间的遗传变异，为生物血缘关系或分类提供依据，还可以分析混合基因组样品等。2、基因定位：例如定位了莴苣霜霉病抗性基因。应用平台分子标记博诚第十五页，共四十七页，2022年，8月28日3、扩增片段长度多态性—

AFLP

扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)用PCR技术在体外扩增DNA时出现的片段长度多态的现象。分子标记博诚第十六页，共四十七页，2022年，8月28日博诚注：引物1：人工接头的互补链引物2：接头互补链上添加1—3个选择性核苷酸片段边接

DNA限制性内切酶随机限制片段引物1PCR引物2PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳分析双链人工接头的酶切片段实验步骤第十七页，共四十七页，2022年，8月28日第十八页，共四十七页，2022年，8月28日第十九页，共四十七页，2022年，8月28日优

点AFLP结合了RFLP和RAPD两种技术的优点1、具有分辨率高2、稳定性好3、效率高的优点AFLP特点1、试验成本高2、对DNA的纯度和内切酶的质量要求很高缺

点第二十页，共四十七页，2022年，8月28日AFLP广泛用于构建遗传连锁图谱、基因组研究、遗传育种、亲子鉴定、遗传病诊断等领域。

AFLP产生的多态性远远超过RFLP和RAPD等技术，因而被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。但该技术已申请专利，在生产及商业上的应用受到一定的限制。分子标记博诚AFLP应用第二十一页，共四十七页，2022年，8月28日AFLP在动物品种鉴定中的应用生物遗传距离鉴定动植物品种鉴定种间鉴定微生物鉴定细菌/病毒种属鉴定分子标记第二十二页，共四十七页，2022年，8月28日4、多重连接探针扩增技术—

MLPA

多重连接探针扩增技术（multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA）是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。分子标记博诚第二十三页，共四十七页，2022年，8月28日1、高效：一次反应可以检测45个靶序列拷贝数的改变。2、特异：可以检测点突变。3、快速：一次实验可以在24小时内完成。4、简便：不同的试剂盒操作基本相同，容易掌握。分子标记优点1、需要精确测量DNA的浓度，样本容易被污染。2、不能用于单个细胞的检测。3、MLPA用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型。4、不能检测染色体的平衡易位。局限性第二十四页，共四十七页，2022年，8月28日MLPA的应用1、检测染色体亚端粒的基因重排—基因诊断和产前诊断2、检测染色体的非整倍性改变——染色体非整倍遗传病检测产前诊断3、检测单核苷酸的多态性（SNP）和点突变分子标记博诚

目前已被广泛应用于基因片段缺失与重复、点突变及甲基化检测等相关疾病的分子生物学研究。第二十五页，共四十七页，2022年，8月28日第二十六页，共四十七页，2022年，8月28日第二十七页，共四十七页，2022年，8月28日5、数目可变串联重复多态性—VNTR

可变串联重复多态性(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)

又称小卫星(MinisatelliteDNA)，是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一10001不等。分子标记博诚VNTR基本原理与RFLP大致相同。第二十八页，共四十七页，2022年，8月28日分子标记1、数量有限，而且在基因组上分布不均匀2、实验操作繁琐、合成探针困难、检测时间长3、成本高缺点1、种类多，多态信息含量较高2、分布广优点VNTR技术特点第二十九页，共四十七页，2022年，8月28日VNTR应用VNTR是一种好的分型方法，并可用于流行病学追踪和菌株亲缘关系确定（1）、结核分枝杆菌基因分型研究（2）、以VNIR为基础的麻风病地理分型（3）、布氏杆菌分子亚型分析（4）、钩端螺旋体MLVA基因分型方（5）、广东人vWF基因40内含子VNTR检测及其在亲缘鉴定中的应用第三十页，共四十七页，2022年，8月28日

应用VNTR技术结核分枝杆菌基因分型第三十一页，共四十七页，2022年，8月28日Geneticfingerprinting分子标记第三十二页，共四十七页，2022年，8月28日第三十三页，共四十七页，2022年，8月28日分子标记Parentsandoffspringhavesimilargeneticfingerprints博诚亲子鉴定第三十四页，共四十七页，2022年，8月28日

短串联重复序列(simpletandemrepeats,STR)又称为简单重复序列（simplesequencerepeats,SSR），也称微卫星标记（microsatellite），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列。其串联重复的核心序列为1-6bp，最常见是双核苷酸重复，即(CA)n和(TG)n。微卫星DNA的高度多态性主要来源于串联数目的不同。由于重复单位的重复次数在个体间,呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。6、短串联重复序列—STR分子标记博诚第三十五页，共四十七页，2022年，8月28日STR技术主要应用在植物育种中，如构建遗传图谱、DNA指纹图谱的建立、种质资源的遗传多样性等。STR分析的主要应用分子标记博诚第三十六页，共四十七页，2022年，8月28日STR标记分子标记博诚第三十七页，共四十七页，2022年，8月28日分子标记STR检测杂交种郑单958纯度P1:父本；P2：母本；1-22：杂交种MP1P2博诚第三十八页，共四十七页，2022年，8月28日7、核苷酸多态性—SNP

核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism)是基于DNA芯片技术的第三代DNA遗传标记技术。

SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每1250bpSNP出现一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义。分子标记博诚第三十九页，共四十七页，2022年，8月28日分子标记博诚第四十页，共四十七页，2022年，8月28日特点高密度、高遗传稳定性、易于分析第四十一页，共四十七页，2022年，8月28日SNP应用领域遗传疾病研究基因连锁和关联分析药物基因组学药物发现/药靶农业/畜牧业遗传学法医/个体识别其它分子标记博诚第四十二页，共四十七页，2022年，8月28日8、SSCP

单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)是一种简便的点突变检测技术，可以分离相同长度但序列不同的核酸。这样就形成了单链构象多态性。

PCR扩增产物变性形成单链后，相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，不同的构象电泳迁移速度出现差异并形成