植物病毒病的诊断与鉴定课件

植物病毒病的诊断与鉴定2010级3班阳植物病毒病的诊断与鉴定植物病毒的形态、结构与组分

2植物病毒病的概况

1植物病毒的鉴定

4植物病毒病的症状特点

3植物病毒病的综合防治

51.植物病毒病的概况病毒（Virus）是包被在蛋白或脂蛋白保护性衣壳中，只能在适合的寄主细胞内完成自身复制的一个或多个基因组的核酸分子，又称分子寄生物。病毒区别于其他生物的主要特征是：1.病毒是个体微小的分子寄生物，其结构简单；2.专性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和场所。按寄主性的不同，病毒分为寄生植物的植物病毒(PlantVirus)、寄生动物的动物病毒以及寄生细菌的噬菌体等。1.植物病毒病的概述植物病毒学研究历史：1886年梅耶尔(Mayer)证明了烟草花叶病害的摩擦传染性;1892年伊凡诺夫斯基(Ivanowski)发现了烟草花叶病的病原可以通过细菌过滤器；1898年伯吉林克(Beijeincku)又发现该病原不是微生物，而是一种传染性活液(contagiumvivumfluidum)，这就是Virus一词的来源；1935年，美国科学家斯坦利（Stanley）获得了烟草花叶病毒的蛋白结晶,认为病毒是可在活细胞内增殖的蛋白（1946年获NobelPrizeinChemistry)。1.植物病毒病的概述植物病毒学研究历史：1936年英国科学家鲍登(Bawden)证明提纯的TMV中含有核酸；l939年Kausch通过电子显微镜观察到植物病毒的形态；1956年Gierrer证明去掉蛋白质的RNA起重要侵染和繁殖作用；1971年Diener发现了很小的RNA（250-400bps)称为类病毒（viroid);1982年发现仅有蛋白质的月元病毒3/14/20231.植物病毒病的概述

植物病毒学研究历史：

1981年，A.Lwoff在巴黎举行的第五届病毒学大会上，这一法国病毒研究所所长阿尔．沃夫，认为病毒不是生物，他的观点如下：生长和分裂独立进化独立的生命体活的原生生物＋＋＋＋细胞＋－－＋线粒体和叶绿体＋－－－膜＋－－－染色体、质体含核酸－－－－病毒－－－－综上所述，认为病毒是有机物，而不是生物。3/14/20232.植物病毒的形态、结构与组成

2.1植物病毒的形态观察需要电子显微镜，度量尺度为纳米(nm)。植物病毒的基本形态为球状、杆状和线条状。球状病毒的直径大多在20一35nm，少数可以达到70-80nm，球状病毒也称为多面体病毒或二十面体(icosahedralparticle)病毒。杆状病毒多为20-80nm×100-250nm，两端平齐；少数两端钝圆，线状病毒多为11—13nm×750nm，个别可以达到2000nm以上。还有少数病毒与以上形态不同，它们有的看上去是两个球状病毒联合在一起，被称为双联病毒(或双生病毒)；有的像弹头，被称为弹状病毒；还有的呈丝线状，柔软不定形。3/14/20232.2植物病毒的结构中间核酸，外为蛋白质衣壳，由许多蛋白质亚基组成，核酸和蛋白质亚基均呈螺旋状排列。杆状或条状病毒的粒体是空心的。

TMV为棒状，CMV球状的。球状病毒：20面体，蛋白质亚基为60个或60的倍数，蛋白质亚基在每个面上不呈螺旋状排列，镶嵌在表面，粒体中心也是空的。核酸链排列还不清楚。3/14/20232.3植物病毒的组成植物病毒主要成分是核酸和蛋白质，核酸在内部，外部由蛋白质包被，称为外壳，有的病毒粒体中还含有少量的糖蛋白或脂类。构成病毒的成分：核酸5--40%，蛋白质60-95%，还有水分和矿物质等。类病毒和拟病毒无蛋白衣壳，无专化性血清学反应，真病毒有专化性血清反应。3/14/20233.植物病毒病的症状特征一、外部症状(Symptom)：病毒病害在症状表现上多为系统发病，表现为变色、畸形，少数引起坏死、腐烂，萎蔫极少发生。变色：花叶(mosaic)，黄化(yellow)。

坏死(negrosis)：也称作枯斑反应，如TMV侵染心叶烟表现为坏死枯斑，马铃薯Ｙ病毒的某些株系侵染烟草可产生脉坏死。

畸形：抑制型：矮化(dwarf)，卷叶(leafroll)，皱叶(rugose)，蕨叶(fernleaf)。

刺激型：丛生(rosette)，肿瘤(tumor)。3/14/20233/14/20233/14/2023花叶（变色界限明显）3.植物病毒病的症状特征二、

病组织的内部和细胞的变化：

1.组织变化：组织坏死：如烟草花叶病毒TMV，它侵染心叶烟引起薄壁组织坏死，有些引起茎部维管束和叶部坏死，烟草花叶病毒侵染大豆引起顶芽和侧枝坏死。一般引起黄化类型的病毒病多是因输导组织、韧皮部坏死引起。组织增生：病毒侵染后，寄主植物体内代谢失调，产生激素，引起增生。3/14/20233/14/20233.植物病毒病的症状特征2.细胞的变化：

花叶和斑驳是由于细胞内叶绿素遭到破坏所致。

内含体(inclussion)：某些植物被病毒侵染后，在病组织中产生的一种特殊结构，存在于细胞质或细胞核中，在显微镜下可以观察到。分为不定型内含体Ｘ－体和结晶体。结晶体：有六角型、长条型、正四面体型等，个别的还有皿状，无色透明，主要是由病毒粒体和寄主的蛋白质有规则地排列形成。Ｘ－体：无一定形状，半透明，通常外有一层膜，也是由病毒粒体和寄主物质构成

内含体的作用：①植物患病毒病后才有，因此，可作为一种诊断的指标。②但并不是所有的病毒病都有内含体，有些必须发育到一定阶段才形成，同时一种病毒还可有多种形态的内含体，因此，单靠内含体诊断还有一定的局限性。

3/14/20233.植物病毒病的症状特征三、患病植物的生理变化：表现为：①病毒侵染后呼吸强度先上升，后下降。②碳水化合物含量下降。③淀粉在叶部积累引起黄化。④多酚氧化酶和细胞色素氧化酶的活性增强，使细胞中毒坏死。⑤光合作用下降，破坏了寄主的叶绿素。⑥植物内源激素水平失去平衡，造成畸形。3/14/20233.植物病毒病的症状特征四、症状变化：一种病毒引起的症状可因病毒、寄主和环境三方面的因素而改变。

1.病毒本身：

①病毒的株系(Strain)：同一种病毒在致病性上也有差异，也称为病毒的生理小种，为了便于与真菌生理小种的区别，称为株系。有强株系(症状表现明显，危害较大)和弱株系(症状不太明显)。如：TMV(弱株系)番茄花叶或斑驳

TMV番茄条斑株系(强株系)坏死，条斑

TMV弱株系侵染烟草引起轻微斑驳，强株系则引起严重花叶。3/14/2023TMV（烟草花叶病毒）3.植物病毒病的症状特征②交互保护作用(crossprotection)：同一种病毒的弱株系先接种植物后，就可以保护寄主免受病毒强株系的严重伤害，即先侵染的病毒可以保护植物不再受亲缘关系较近的另一种病毒的侵染。如果两种病毒无亲缘关系则没有这种保护作用。③拮抗作用和协生作用：

拮抗作用：一种病毒侵染寄主植物后，可抑制另一种病毒再对植物的侵染。如烟草蚀纹病毒可抑制天仙子花叶病毒和马铃薯Ｙ病毒对烟草的侵染。

协生作用：两种病毒侵染一种寄主植物后，可使症状比单独侵染时更为严重，加剧为害。如：番茄花叶病毒轻微斑驳>番茄坏死马铃薯Ｘ病毒轻微斑驳

3/14/20233.植物病毒病的症状特征3.环境因素：环境因素可抑制或改变症状的表现。（1）温度：〉35℃或〈10℃病害症状轻微，特别是对于花叶病，如油菜花叶病和TMV。隐症：已经表现病毒病症状的植株，由于环境条件改变，症状消失的现象。这种隐症在条件合适时又可重新表现症状。隐症：条件不同。潜伏侵染：寄主不同。（2）光照：过强、过弱都会影响症状的表现。多数在光弱时花叶病症状容易表现，接种易成功3/14/2023植物病毒的分类是将已知病毒按一定标准、相似程度或相关性的顺序排列，拼成一个系统，即分类系统。植物病毒鉴定的主要目的是确定一种病毒在分类系统中的地位，由于植物病毒个体微小，结构简单，对寄主的依赖性强，鉴定工作难度大，技术性强，对工作条件的要求高。鉴定植物病毒过去大多采用病毒间生物学特性的差异，如所致症状类型、传播方式、寄主范围等；现在则增加了病毒核酸、蛋白分子生物学、生物化学等方面的方法。常用的方法有生物学实验、血清学检测和电子显微镜观察等。3/14/20234.植物病毒的鉴定二、电子显微镜技术与光学显微镜相比，电子显微镜使用光源的波长更短(属于短波电子流)，因此分辨率也大大提高(9.9×l0-11m，比光学显微镜高千倍以上)。但是电子束的穿透力低，样品厚度必须在10~100nm之间。所以电镜观察需要特殊的载网和支持膜，需要复杂的制样和切片过程。病毒观察最常用的是负染技术和免疫电镜技术。所谓负染，是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外围的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。与超薄切片(正染色)技术相比，负染不仅快速简易，而且分辨率高，目前广泛用于生物大分子、细菌、原生动物、亚细胞碎片、分离的细胞器、蛋白晶体的观察及免疫学和细胞化学的研究工作中，尤其是病毒的快速鉴定及其结构研究所必不可少的一项技术。3/14/2023三、血清学技术

抗血清制备：利用植物病毒衣壳蛋白的抗原(antigen)特性，可以制备病毒特异性的抗血清(antiserum)。先将纯化的植物病毒注射小动物(兔子、小白鼠、鸡等)，一定时间后取血，获得抗血清。血清制备的关键是病毒的纯化，纯度高的病毒才能获得特异性强的抗血清。血清反应植物病毒与其血清的反应有好多种，但依据的原理都是抗原与抗体的特异性结合。最常用的两种方法是琼脂双扩散和酶联免疫吸附测定法。3/14/2023琼脂双扩散法：在一定浓度的琼脂凝胶中，抗体和抗原互相扩散，在适当的位置形成沉淀；沉淀线的形状说明抗原和抗体的相互关系。酶联免疫吸附(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)法：该方法利用了酶的放大作用，使免疫检测的灵敏度大大提高。与其它检测方法相比较，ELISA有突出的优点：一是灵敏度高，检测浓度可达1-10ng／m1;二是快速，结果可在几个小时内得到；三专化性强，重复性好；四是检测对象广，可用于粗汁液或提纯液，对完整的和降解的病毒粒体都可检测，一般不受抗原形态的影响；五是适用于处理大批样品，所用基本仪器简单，试剂价格较低,且可较长期保存。具有自动化及试剂盒的发展潜力。ELISA是实现“快速、准确、经济”检测的最好手段之一3/14/2023四、核酸杂交及PCR技术血清学技术利用的是病毒衣壳蛋白的抗原性，检测的目标是蛋白。由于核酸才是有侵染性的，仅仅检测到蛋白并不能肯定病毒有无生物活性。因此，核酸检测技术也是鉴定植物病毒的更可靠方法，主要有核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)方法比较常用。核酸杂交主要在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补的DNA之间存在着碱基的互补关系。在一定的条件下，RNA--DNA形成异质双链的过程称为杂交。其中预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段叫做杂交探针(Probe)，由于大多数植物病毒的核酸是RNA，其探针为互补DNA(complementaryDNA，cDNA)，也称为cDNA探针。核酸检测不仅可以检测到目标病毒的核酸，而且还可以检测出相近病毒(或核酸)间的同源程度。3/14/2023聚合酶链式反应(PCR)是在短时间内大量扩增核酸的有效方法，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。从已知序列合成两段寡聚核苷酸作为反应的引物，它们分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补且位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先在过量的两种引物及4种dNTP参与下对模板DNA进行加热变性。随之将反应混合液冷却至某一温度使引物与其靶序列发生退火。此后退火引物在耐热的洲A聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这一循环。每完成一个循环，理论上就使目的DNA产物增加1倍，在正常反应条件下，经25—30个循环扩增倍数可达百万。

PCR扩增在检测标本中病原的核酸序列、由少量RNA生成cDNA文库、生成大量DNA以进行序列测定、突变的分析等方向已经得到广泛的应用。3/14/2023五、物理化学等特征在植物病毒研究的过程中，人们发现不同的病毒对外界条件的稳定性不同，这便成为区别不同病毒的依据之一。随着新病毒种类的发现和分子生物学研究的深入，人们也逐渐认识到这些物理特性在区分不同病毒中的局限性。1.稀释限点(DilutionEndPoint，DEP)保持病毒侵染力的最高稀释度，用10-1，10-2，10-3……表示，它反映了病毒的体外稳定性和侵染能力，也象征着病毒浓度的高低。2.钝化温度(ThermalInactivationPoint,TIP)处理十分钟使病毒丧失活性的最低温用摄氏温度表示。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有有45℃；最高的是烟草花叶病毒，为97℃；而大多数植物病毒在55—70℃之间；3.体外存活期(Longevityinvitro，LIV)在室温(20~22℃)下，病毒抽提液保持浸染力的最长时间。大多数病毒的存活期在数天到数月。3/14/20234．沉降系数及分子量