体外放射分析-2 RIA与IRMA教材课件

第三节

放射免疫分析（RIA）与免疫放射分析（IRMA）蔡华伟四川大学华西医院核医学科Page

2体外分析发展史1950年美国免疫学家Perssmen使用放射性碘标记抗原研究了抗原- 抗体免疫反应；1959年美国生物学家Yalow和Berson建立了放射免疫分析法（RIA）;1960年英国Ekins建立了甲状腺激素的竞争蛋白结合分析法（CPBA）;1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析法（IRMA）;1970年Lefkowitz建立了受体的放射配基结合分析法（RBA）;1983年Soini和Kojola建立了时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）;RIA是一切体外分析法的鼻祖！Page

3放射免疫分析的定义：利用定量的放射性标记抗原与待测定的非标记抗原，同时与限定量的特异性抗体发生竞争结合反应，反应平衡后分离出抗原抗体复合体，通过测量放射性复合物的量来计算出非标记抗原的量。一.放射免疫分析（RIA）的基本理论放射免疫(RIA)竞争结合反应条件：*Ag与Ag免疫活性相同Ag恒量，Ab恒量*Ag与Ag总量大于Ab有效结合位点

Ag：抗原*Ag：标记抗原Ab：抗体Ag-Ab：抗原抗体复合物*Ag+AbAg+*Ag-Ab+*AgAg-Ab+Ag（B）（F）K1K2K2K1Ag*与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争性与Ab结合，当Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*与Ag之和大于Ab时，则Ag*-Ab复合物的形成受Ag含量的制约，二者之间存在竟争抑制的函数关系;即随着Ag浓度的增加，*Ag-Ab复合物就减少，因为Ag*对Ab的结合被Ag竞争性抑制。根据这一函数关系的标准曲线，可求出被测抗原的含量。Page

6k1[AgAb]k1=令=Kk2[Ag]·[Ab]k2

[AgAb]则K=

[Ag]·[Ab]K即为反应的平衡常数，又叫亲合常数Ka。它反映抗原和体间亲合力的大小，直接影响分析的灵敏度。对特定的一对抗原抗体，在一定温度下，K值是固定的。温度与K值之间一般是负相关关系。Page

7放射免疫的质量作用反应函数式B2-B×(1++)+=0[Ab0][Ag0]Ka×[Ag0]1[Ab0][Ag0]B=反应平衡时结合物百分比[Ag0]=Ag原始浓度[Ab0]=Ab原始浓度Ka=亲和平衡常数二、放射免疫基本操作步骤1.加样：加样总体积须保持一致，所处的介质环境也要一致；平衡加样法与顺序加样法。2.孵育：根据不同的分析对象，孵育的温度和时间可能有所不同，一般是37℃或4℃；3.分离：当反应平衡后，将抗原抗体复合物（B）与游离抗原（F）进行分离；4.测量：测量抗原抗体复合物或游离抗原的放射性；5.数据处理：绘制标准曲线和计算待测物浓度。Page

9BFB/F0.670.3320.50.510.330.670.50.170.830.2放射免疫的反应方式平衡加样法：标准（待测）Ag+Ab+标记*Ag

温育分离测定顺序加样法（非平衡法，两步法）：Ag+AbAg.Ab+Ab*Ag+Ab*Ag.Ab+*Ag顺序加样法可一定程度上提高分析灵敏度第一步：第二步：标准曲线绘制：采用一系列已知浓度的待测标准抗原，在相同条件下与一定量的*Ag，和定量Ab共同反应，反应平衡后分离B与F，测定B的放射性，以每一管标准品浓度为横坐标，以B的放射性计数（CPM）或结合率（B/F%，B%，F%）作为纵坐标，绘制浓度与反应参数间的标准曲线（Calibrationcurve）或称剂量反应曲线（Dose-responsecurve）。放射免疫标准曲线Page

12放射免疫标准曲线Page

13放射免疫标准曲线的绘制

在实际的操作中，为了绘制标准曲线，我们需要设立一下几个反应管：最大结合管（B0）：标准抗原的量为0，仅有标记抗原和特异性抗体，反应后分离所得B的放射性为B0。这表示标记抗原和抗体的最大结合值，也即是待测样品的最小测量点。非特异结合管（NSB）：使用蒸馏水代替特异性抗体，在反应后测得的放射性。这表示标记抗原和杂质蛋白或容器管壁等的结合情况，也反映了我们实际工作条件下的环境所带来的误差。3.总防射性管（T）：反应后不分离，直接测得的放射性就是总放射性。这表示游离的标记抗原与结合的标记抗原-抗体复合物的总放射性。这也代表了我们实验的最大量程。T%=B%+F%=100%。4.标准管（B1–Bn）：加入不同浓度的标准抗原后，再加入等量的标记抗原和特异性抗体进行反应。反应结束后分别分离出每管的沉淀，测定出的沉淀放射性作为B。B1-Bn是标准曲线绘制的依据。5.样品管（Bx）：使用待测的临床样本代替标准管中的标准抗原，在相同条件下进行反应和分离，得到的沉淀放射性，其对应的浓度可以在绘制的标准曲线上对照得出。Page

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16放射免疫标准曲线B%，B/F%，B/Bo等反应变量在均可作为标准曲线的纵坐标单位；选用的反应变量不同，标准曲线形状也不同，但对应的标准抗原浓度变化是一致的。Page

17待测物浓度测定：根据待测抗原中B的CMP值或结合率，在标准曲线上求出待测抗原浓度。Page

18三.放射免疫分析反应中的影响因素缓冲液：常用pH=7.0~8.5，离子浓度0.05~0.1M的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。反应体积：小体积可提高灵敏度，但增大了误差。温度和时间：4℃或37℃，取决于待测样本。反应物比例：减少抗体与标记抗原的用量可提高灵敏度，增加抗体与标记抗原的用量可扩大测定范围。添加剂：低浓度NaN3，EDTA、肝素、抑肽酶对一般分析无影响Page

19放射免疫分析反应中的分离方法二抗法：非特异性低，但沉淀较差；PEG法：沉淀较好，但非特异性高；二抗-PEG法：较好，目前常用；固相法：较好，目前常用；磁珠分离法：较好，但成本高Page

20四.放射免疫分析的数据处理数据处理的基本方法数据处理就是将实测结果按一定函数关系，以标准曲线的形式拟合出来，不同的数学模型，其曲线性状可能略有不同，但测量结果不应该出现很大误差。最早的数据处理使用作图法，但目前应用的主要是以质量作用定律为基础的几种数学模型以便适应自动化检测。Page

212.RIA数据处理的几种数学模型1）Logit-log模型2）四参数或五参数Logistic模型3）四参数单位点质量作用模型以药物浓度的对数为横坐标，B/F对数函数为纵坐标，完成的的一元方程直线图，拟合性较差。logitY=a+blogitY=ln(logX/1-B/Bo)

a＝截距b斜率为"-"值

Y＝结合率Y与X呈负相关优点：操作简单，普通计算器也可拟合缺点：由于Log0无解，拟合时缺失0剂量点，降低了灵敏度；如有突出值，拟合线会变化；顺序加样法不可用。1）Logit-log模型Page

232）四参数Logistic模型IAEA和WHO推荐的数据处理模型，该方法由Logit-Log法演化而来，其函数式如下：

该方法通过拟合求NSB，而不缺失0剂量点，因此优于logit-log法。顺序加样法需对应添加不对称因子的五参数模型。ad(NSB)a=Bo,d=NSB,c=使Bo下降一半的抗原浓度,b=Logit-Log线性回归所得斜率Page

243）四参数单位点质量作用模型稳定性最佳的标准曲线模型，可排除个别标准管的坏点影响。

R2×[b(c+*p+X)+q}+R×{c(b-1)+q-*p-X]-c=0R=F/Bb=[NSB]/[F]c=1/Ka*p=[*Ag]X=[Ag]q=[Ab]Page

25免疫放射分析（IRMA）的基本理论免疫放射分析的定义：利用过量的放射性标记抗体与待测定的非标记抗原，发生结合反应，反应平衡后分离出抗原抗体复合体，通过测量放射性复合物的量来计算出非标记抗原的量。该反应是非竞争性结合的全量反应。免疫放射(IRMA)非竞争结合反应放射核素标记在抗体上，与待测抗原结合后，用一定手段将多余抗体除去，测定复合物的放射性，其活度与待测抗原呈正相关。Ag+*Ab*Ag-Ab+*Ab*Ab*Ab*Ab（B）（F）RIA与IRMA的反应比较示意图Page

28免疫放射(IRMA)的数学模型B2-B×(1++)+=0[Ag0][Ab0]Ka×[Ab0]1[Ag0][Ab0]B=反应平衡时结合物百分比[Ag0]=Ag原始浓度[Ab0]=Ab原始浓度Ka=亲和平衡常数Page

29RIA与IRMA的标准曲线比较Page

30免疫放射分析反应(IRMA)的分组分组名称代表符号Ag*Ab分离试剂标准曲线组总放射性管T——√——非特异结合管NSB——√√最大结合管B0√√√标准管B1-Bn√√√样品组样品管U√√√质控组质控管QC√√√待测物浓度过高出现的平台效应

被测物质浓度标准曲线的有效范围结合率（%）无法测量的平台效应Page

32免疫放射分析反应(IRMA)的基本操作1.加样；同RIA2.孵育：一般是37℃；3.分离；4.测量：测量抗原抗体复合物或游离抗

体的放射性；5.数据处理：与RIA类似Page

33免疫放射分析(IRMA)的发展原始IRMA法单克隆抗体技术单克隆抗体IRMA法固相技术双抗体夹心IRMA法生物素-亲和素放大技术IRMA-生物素-亲和素测定系统Page

34免疫放射分析(IRMA)的分类1.直接IRMA法：2.双抗体夹心IRMA法：3.标记第三抗体法（间接IRMA）4.生物素-亲和素IRMA法（BAS-IRMA）Page

35固相双抗体夹心IRMA示意图杂质标记抗体双抗夹心IRMA仅适用于有多个抗原决定簇的多肽和蛋白质抗原准备固相抗体；加入待测抗原；完全结合后加入标记抗体；洗去游离标记抗体；测定固相抗体上的复合物。Page

36间接IRMA示意图固相包被一抗待测抗原第二抗体标记的第三抗体第三抗体针对第二抗体的IgG，只需使用第三抗体作为通用示踪剂，即可应用于所有非固相二抗的检测。Page

37BAS-IRMA原理示意图利用一个IgG上可标记多个亲和素-生物素分子，来达到检测放大的效果，提高检测灵敏度。Page

38免疫放射(IRMA)的数据处理函数模型及函数式曲线类型B%-D曲线B%-LogD半对数S曲线B/Bmax%-LogD半对数S曲线CPM–LogD半对数S曲线，在一定范围内为直线五参数Logistic模型曲线三参数单位点质量作用模型曲线Page

39免疫放射(IRMA)的主要影响因素待测抗原性质：双位点IRMA要求待测抗原具有两个以上的结合位点；抗原在固相抗体上结合的稳定性：双位点IRMA时，待测抗原越多，抗原从固相抗体上分离的倾向更明显，高浓度的准确度比低浓度时差；标记抗体：标记抗体用量越多，非特异性结合越高；反应温度及时