基因工程的基本操作程序-彭真

基因工程的基本操作程序——彭真第1页/共66页基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定第2页/共66页一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成请阅读P9第一和二两段第3页/共66页（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库

基因组文库部分基因文库（cDNA文库）第4页/共66页基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较第5页/共66页限制酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装1)基因组文库(Genomiclibrary)

是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。1、基因文库第6页/共66页cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库2)cDNA文库(cDNAlibrary)基因重组反转录酶mRNAcDNA第7页/共66页按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组DNA ---基因组DNA文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库（部分）②基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。①基因文库的分类第8页/共66页①：直接分离法供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(鸟枪法)多用于原核生物第9页/共66页逆转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成逆转录②人工合成法（真核生物）推测推测单链DNA合成第10页/共66页①基因组文库的构建（2）基因文库的构建方法通过对受体菌的培养而储存基因第11页/共66页②cDNA文库的构建-----反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)第12页/共66页基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以第13页/共66页怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?第14页/共66页依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性④从基因文库中得到目的基因的方法第15页/共66页2、利用PCR技术扩增目的基因第16页/共66页1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第17页/共66页模板DNA95℃第18页/共66页PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物第19页/共66页PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第20页/共66页PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始第21页/共66页PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第22页/共66页PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束第23页/共66页第24页/共66页①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________、___________。等②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）第25页/共66页⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第26页/共66页第27页/共66页PCR的基本反应步骤变性90-95˚C延伸70-75˚C退火55-60˚CPCR总结：第28页/共66页Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020第29页/共66页3、人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成第30页/共66页1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游

编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录第31页/共66页非编码区非编码区编码区编码区上游

编码区下游

与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质。第32页/共66页RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。

转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。

转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。第33页/共66页原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子启动子第34页/共66页真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子

外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子第35页/共66页原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码第36页/共66页用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。用_____________切断的基因，使其产生_________________。将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶1.过程:二、基因表达载体的构建——核心2.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用第37页/共66页质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:第38页/共66页2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?第39页/共66页启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第40页/共66页①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意第41页/共66页三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达第42页/共66页1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法

①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。第43页/共66页③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌第44页/共66页基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物第45页/共66页（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物第46页/共66页胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第47页/共66页2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物胚胎早期培养第48页/共66页常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2＋处理，增加细菌细胞壁的通透性第49页/共66页受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞第50页/共66页四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定第51页/共66页（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因①首先取出转基因生物的基因组DNA②用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:第52页/共66页归纳步骤第53页/共66页DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。P15思考与探究第54页/共66页2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质①方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交②过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA第55页/共66页提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质

出现杂交带脱分化组织培养第56页/共66页若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达第57页/共66页归纳步骤第58页/共66页类型步骤检测内容

方法

结果显示

分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和D