从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案一、综述：精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。1．了解生物分离提纯的原理和方法技术2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。同而异。一生物的过程称为微生物纯化。其基本原理是选择适度、温度和氧等要求，或加其他微生物生长的环境，从而值值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源【6】。倍。土样采集：采集广大植物园内的有机土壤，和生化楼下花坛的有机土壤营养琼脂(%)：蛋白胨1牛肉膏氯化钠琼脂~蒸馏水将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至~。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%)：可溶性淀粉牛肉蛋白氯化钠琼脂~校正pH至~粉2黄豆饼粉CaClMgSO4NaClK2HPO4柠檬酸钠硫酸氨(溶解后加)校正pH值葡萄糖蛋白胨培养基(试验用)(%)：葡萄糖蛋白胨K2HPO4校正pH~蛋白胨水培养基(吲哚试验用)(%)：蛋白胨1%氯化钠%校正pH~西蒙氏柠檬酸盐培养基(%)：氯化钠硫酸镁(MgSO4·7H2O)磷酸二氢铵磷酸氢二钾柠檬酸琼脂2溴麝香草酚蓝溶液4酚红试剂校正配制营养明胶培养基(%)：蛋白胨、牛肉膏、明胶，调pH~耐盐培养基(%)： ①蛋白胨1牛肉膏氯化钠2琼脂~蒸馏水 ②蛋白胨1③蛋白胨1④蛋白胨1氯化钠10琼脂~蒸馏水氯化钠20琼脂~蒸馏水 氯化钠25琼脂~蒸馏水 加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至~。加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶染料炭酸复红液;香柏油、二甲苯或其它用具无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培养皿土样三角瓶烧杯洗瓶 100℃左右水浴，水浴锅温度恒定后维持15min(制悬液时就应 ④涂布平板用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板(重复)。37℃下恒温划线接种(分区划线法)：在上述不同稀释度培养基中挑取不菌种。一部分用来做染色实验。3、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种：接于倒好的淀粉牛肉膏培区中培养24h。记录阳性和性菌的编培养后将出氏染色镜革兰氏染色步骤：洗。色染色镜检： 状和位置，查伯杰细菌手册)的标签贴上，相同编号也要与平板上菌落编号相对应)。养24h。种的影响；明胶液化试验；试验。将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板。(培养基厚度为一般培养基的到2倍)板倒置于4℃ (冰箱)、37℃(或者室温)，60℃下保温培养24小时，观察细菌的生长状 种，)或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24-48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临 ·糖类发酵试验(葡萄糖、木糖和乳糖发酵) 和糖的 (加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察)，如有吲培养基的试管分别标记待测菌种的编号和空白对后置于37℃恒温箱中24h。观察结果，若培养基变蓝色，则表明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源于产酶液体培养基50/500mL,相同条件培h8000r/min，离心10min,取上清液测酶活,每个样品重复3次,最后min后加适当稀释的酶液，反应5min后，用5mlLH2SO4终ml0nm处测光密度。以水代替反应液为空白，以不加酶液(加同样体积的缓冲液)的管为对照。酶活力根据下式计算：酶活力(u/ml