smad在马兜铃酸肾病中的作用机制

smad在马兜铃酸肾病中的作用机制第1页/共24页马兜铃酸肾病马兜铃酸肾病（AAN）：为一种全球性疾病，是使用中草药严重的并发症之一。然而导致AAN的发病机制尚不明确，继而阻碍了对AAN病人的有效治疗。AAN的特征是进行性肾损害，表现为肾小管坏死、萎缩和肾间质纤维化。肾小管间质纤维化是终末期肾病的共同特征，也是决定肾脏疾病进展的主要因素，因此深入研究肾纤维化发生发展的机制尤为重要。肾脏纤维化是以胶原蛋白合成增加、降解受到抑制导致大量细胞外基质（ECM）不恰当沉积和分布为特点。第2页/共24页TGF-β的生物特性各种肾病发展至肾纤维化与多种细胞因子有关，其中转化生长因子β（TGF-β）/smad信号通路在肾纤维化过程中起重要作用，并且被公认为是最主要的致纤维化通路。TGF-β----(transforminggrowthfactorbeta,转化生长因子-beta)是一种多向性、多效性的细胞因子，以自分泌或旁分泌的方式通过细胞表面的受体信号转导途径调节细胞的增殖、分化、凋亡，对细胞外基质的合成、创伤的修复、免疫功能等有重要的调节作用。第3页/共24页Smads蛋白Smads蛋白是TGF-β/Smad信号通路中细胞内信号转导的中介分子。Smad2、smad3Smad1、smad5smad8、smad9smad4Smad6、smad7红色标记者为参与TGF-β信号传导的smad蛋白。第4页/共24页TGF-β/smad3信号通路的传导信号通路在传导中的3个主要步骤1、TGF-β与细胞表面受体结合，形成异源三聚体2、异源三聚体通过激活R-smad蛋白，将信号传导至胞浆内3、R-smad与Co-smad结合后，转移至细胞核，与靶基因结合，调节蛋白合成第5页/共24页TGF-β/smad3信号转导示意图第6页/共24页本研究进行了一项假设试验，即假设转化生长因子β/Smad3是导致慢性AAN的关键途径。本研究分为体内试验和体外试验两部分。第7页/共24页体内试验—技术路线IHC、RT-PCRT-IHC、westernblot、RT-PCRIHC、RT-PCRTGF-βI，P-Smad2/3α-SMA和E-cadCol.I和Col.III肾功能检测建立smad3WT/KOCAAN模型血清肌酐试剂盒考马斯-尿蛋白第8页/共24页结果第9页/共24页结果B：4周后，smadWT小鼠Scr含量升高显著，smad3KO升高减弱。C：整体水平上smad3KO小鼠蛋白尿量增加不明显。说明smad3KO对肾损伤有保护作用第10页/共24页Smad3WTCol1和3大量积聚，Smad3KO未出现积聚现象。第11页/共24页结果E-cad和α-SMAA和B:smad3WT腹腔注射4周C:Smad3KO腹腔注射4周A.B.D:α-SMA（肌成纤维细胞）大量蓄积C.D:蓄积程度减弱。第12页/共24页结果WT型α-SMA表达显著增加，KO型没有出现增加显著现象。第13页/共24页第14页/共24页体外试验总结小结（一）以上实验结果表明smad3蛋白在CAAN过程中有重要作用，基因敲除Smad3后可明显减少CAAN模型中Scr和蛋白尿的含量，有效降低Col.I、Col.III、α-SMA、TGF-β1、P-smad2/3的表达量，从而抑制了细胞外基质大量蓄积造成的纤维化以及其它更严重的肾脏疾病。第15页/共24页体外试验细胞试验AA处理RETCAA处理导入siRNA后的RETCTGF-β1、Col.I、α-SMA、E-cad第16页/共24页AA处理正常TEC第17页/共24页以上细胞外实验说明AA对肾小管上皮细胞有较严重的损伤作用，导致Col.I、α-SMA、TGF-β1大量蓄积，E-cad表达量下降。AA处理正常TEC第18页/共24页A表示smad2的siRNA不影响smad3的表达，smad3的siRNA不影响smad2的表达然后进行B实验B表示添加AA和S3-siRNA的细胞中，α-SMA下降，E-钙粘蛋白升高；添加AA和S3-siRNA的细胞中，α-SMA和E-钙粘蛋白都有上升趋势。AA处理导入干扰RNA的TEC第19页/共24页smad3siRNA：本该升高的降低了，smad2siRNA：原来升高的现在还是升高。第20页/共24页结论小结（二）AA可引起大鼠肾小管上皮细胞Col.I、α-SMA、TGF-β1上调，引起E-钙粘蛋白下调，且都呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。加入干扰RNA后证明smad3干扰RNA可以有效的抑制Col.I、α-SMA、TGF-β1的上调及E-钙粘蛋白的下调，而smad2没有明显作用。第21页/共24页总结TGF-β/Smad3信号通路在CAAN有重要作用，特异性地敲除sma