RNA分子生物学技术

RNA分子生物学技术第1页/共118页导论再谈中心法则RNA世界RNA生物学功能RNA组学第2页/共118页再谈中心法则第3页/共118页4中心法则与RNA1961年,发现DNA依赖的RNA聚合酶1968年,提出RNA是最早的信息分子1982~1983年,发现核酶

1986年,提出“RNAworld”1947年,RNA第一次被描述1968年,提出中心法则第4页/共118页中心法则与组学第5页/共118页基因组：一种生物拥有的所有遗传信息的总合是一个细胞（或病毒）所承载的全部遗传信息，它代表了一种生物所具有的全部遗传信息。真核生物基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）及线粒体DNA或叶绿体DNA的全部序列，既有编码序列，也有大量存在的非编码序列。细菌基因组包含了拟核和质粒中的DNA序列。病毒基因组有的为DNA（DNA病毒），有的则为RNA（RNA病毒）。*基因组（genome）第6页/共118页基因组学：包括结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学基因组学（genomics）是阐明整个基因组的结构、结构与功能的关系以及基因之间相互作用的科学。研究内容：结构基因组学（structuralgenomics）:

遗传图谱、物理图谱、序列图谱以及转录图谱和大规模DNA测序。功能基因组学（functionalgenomics）:分析鉴定基因组功能。比较基因组学（comparativegenomics）：基因组之间比较鉴定，研究生物进化，预测新基因。第7页/共118页转录组学：研究全部RNA的表达及功能转录组（transcriptome）

指生命单元（通常是一种细胞）所能转录出来的所有RNA——包括指导蛋白质翻译的mRNA和非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)的总和。RNA功能基因组学

又称RNA组学（RNomics）：是分析、鉴定非信使小RNA（smallnon-messengerRNA,snmRNA）在特定状态下表达差异、功能及其与蛋白质的相互作用。第8页/共118页RNA组学：研究全部非mRNA小RNA的集合人类基因组序列特点：2万2.5万个基因，与蛋白质合成有关的序列占整个基因组的2%左右，其余98%的基因组序列没有得到注释。RNA组学研究范畴：小分子RNA，包括

snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）第9页/共118页

以细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质即蛋白质组（proteome）为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态；了解蛋白质之间的相互作用与联系；并在整体水平上研究蛋白质调控的活动规律，故又称为全景式蛋白质表达谱（globalproteinexpressionprofile）分析。

蛋白质组学（proteomics）蛋白质组：全景式蛋白质表达谱分析第10页/共118页蛋白质组学的中心任务：

研究细胞内所有蛋白质组成及其活动规律蛋白质组学的研究内容：一、蛋白质组表达模式的研究，即结构蛋白质组学（structuralproteomics）二、蛋白质组功能模式的研究，即功能蛋白质组学（functionalproteomics）第11页/共118页蛋白质组学的主要任务：蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合生物质谱、Western印迹、蛋白质芯片等技术，对蛋白质进行全面的鉴定研究。翻译后修饰的鉴定：磷酸化、糖基化、酶原激活等过程。蛋白质功能确定：包括蛋白质定位研究，蛋白质活性，蛋白质相互作用，酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析，配基-受体结合分析等。第12页/共118页与蛋白质组研究相关的数据库蛋白序列数据库（SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列数据库（Genbank，/EMBL，http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式数据库（Prosite，http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白质二维凝胶电泳数据库、蛋白三维结构数据库（PDB，/；

FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻译后修饰数据库（O-GLYCBASEhttp://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）第13页/共118页疾病基因组学：

研究疾病相关基因、揭示疾病发病机制疾病基因组学研究的两大任务：疾病基因或疾病相关基因疾病易感性的遗传学基础第14页/共118页药物基因组学：

研究遗传变异对药物效能和毒性的影响药物基因组学（pharmacogenomics）是功能基因组学与分子药理学的有机结合，它不是以发现人体基因组基因为主要目的，而是运用已知的基因组学知识改善患者的治疗。以药物效应及安全性为目标，研究各种基因突变与药效及安全性的关系，是研究高效、特效药物的重要途径，通过它为患者或者特定人群寻找合适的药物。使药物治疗模式：诊断定向治疗→基因定向治疗。第15页/共118页肿瘤基因组解剖工程：

阐明肿瘤相关基因

基因激活和/或失活及其复杂的相互作用是肿瘤发生的根本原因

癌症基因组解剖计划（CancerGenomeAnatomyProject，CGAP；又称肿瘤cDNA工程）：拟逐步建立人类肿瘤细胞表达基因索引发展快速分析肿瘤细胞的技术获知与肿瘤相关的基因、蛋白质及其他生物标记物建立肿瘤研究信息（数据与分析工具）、资源（克隆和文库）及技术和方法学平台第16页/共118页代谢组学（metabonomics）

测定一个生物/细胞中所有小分子（Mr1000）组成，描绘其动态变化规律，建立系统代谢图谱，并确定这些变化与生物过程的联系。

生命过程的表观、生物化学的终极目标。代谢组学：研究内源性代谢物质的动态变化

规律及与生物过程的联系第17页/共118页代谢组学分为4个层次：①代谢物靶标分析（metabolitetargetanalysis）②代谢谱分析（metabolicprofilinganalysis）③代谢组学（metabonomics）④代谢指纹分析（metabolicfingerprintinganalysis）代谢组学研究对象：生物体液——血样、尿样等完整的组织样品、组织提取液和细胞培养液（一）代谢组学的任务：

分析生物/细胞代谢产物的全貌第18页/共118页

主要的分析工具①核磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）：

氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）及磷谱（31P-NMR）。②MS：

MS按质荷比（m/z）进行各种代谢物的定性或定量分析，可得到相应的代谢产物谱。③色谱及联用技术：

使样品的分离、定性、定量一次完成，具有较高的灵敏度和选择性。（二）代谢组学的主要分析工具：

核磁共振、色谱及MS第19页/共118页代谢组学研究侧重于代谢物的组成、特性与变化规律，与生理学的联系更加紧密。疾病→机体病理生理过程变化→代谢产物的改变→比较分析与正常人的代谢产物差异→发现和筛选出疾病新的生物标记物→对相关疾病作出早期预警→发展新的有效的疾病诊断方法。药物代谢组学的研究，可阐明药物在不同个体体内的代谢途径及其规律，将为合理用药和个体化医疗提供重要依据。（三）代谢组学：

是开展预测医学和个体化医学的重要手段第20页/共118页RNA世界

RNA是一种可以作为信使、酶和结构组分的多功能分子。

RNA与DNA、蛋白质，甚至RNA本身都能发生相互作用，在生命活动的各个环节中发挥重要功能。大量非编码RNA的发现及其生物学功能多样性被揭示。核酶的发现使得人们相信在生命的进化过程中曾经存在着一个活跃的RNA世界。

人们认识到RNA的研究在揭示生命本质和疾病防治方面都有着不可或缺的意义。第21页/共118页1982-1983年，ThomasCech和SidneyAltman等分别发现RNaseP的RNA亚基和嗜热四膜虫的前体rRNA中的居间序列(Interveningsequence．IVS)都具有酶的催化活性，它们是最早被发现的具有催化作用的RNA分子——核酶（ribozyme），为RNA转录后加工机制提供了新的认识，并为生命起源的探讨开拓了新的境界。1986年，WalterGilbert创造了“RNAworld”这个名词，用于描述其提出的关于分子起源的假说：在生命进化的早期存在一个只有RNA，没有DNA和蛋白质的世界；RNA既是遗传信息载体又具有酶的催化功能，它们催化自身的合成。

第22页/共118页“RNA世界”目录TheRNAWorld

(ThirdEdition,2006)RaymondF.GestelandThomasR.CechJohnF.Atkins

ColdSpringHarborLaboratoryPress第23页/共118页一、起源于RNA与RNA起源1.RNA的历史、化学、地理生物学2.对RNA世界起源认识的进展3.原始细胞：包含遗传聚合体的膜囊泡第24页/共118页二、建立功能RNA4.核糖开关与RNA世界5.自我切割核酸酶的催化策略：RNA世界的遗迹？6.I型内含子如何起作用：RNA结构与功能的范例研究第25页/共118页三、退出古老的RNA世界——合成酶与核糖体7.RNA、脂质、膜8.氨基酰-tRNA合酶9.RNA在蛋白质合成中的作用10.从RNA世界进化而来的核糖体与蛋白质翻译第26页/共118页四、现代RNA世界中丰富的RNA角色11.核糖核蛋白世界12.不断扩展的小核内核糖核蛋白世界13.剪接体结构与功能14.RNA分子位点特异性修饰的范例：尿嘧啶插入、缺失

RNA编辑15.端粒酶RNA16.形状多变的mRNA：折叠的得与失第27页/共118页五、RNA继续战胜DNA

17.II型内含子：一类剪接RNA并入侵DNA的核酶

18.SINE和LINE：麻烦制造者、破坏者、先行者

19.短RNA生物学

20.细菌内小RNA调控子的多能性

21.参与哺乳动物基因剂量调控的长链非编码RNA第28页/共118页六、新兴工具

22.RNA二级结构预测

23.一种用于全原子RNA建模的模块层次方法

24.功能RNA序列的自动化体外筛选与芯片应用

25.基于单分子方法的RNA折叠、展开、动力学研究第29页/共118页RNA有何基本特点与功能？第30页/共118页RNA与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。RNA比DNA小的多。RNA的种类、大小和结构远比DNA表现出多样性。RNA的基本特点

第31页/共118页RNA生物学功能构成核糖核蛋白体小核内核糖核蛋白世界剪接体结构与功能RNA分子位点特异性修饰的范例：尿嘧啶插入、缺失RNA编辑端粒酶RNA形状多变的mRNA：折叠的得与失第32页/共118页RNA的种类、分布、功能第33页/共118页CrystalStructureoftheRibosomeat5.5

Å

ResolutionScience.2001.292:883-896.MaratM.Yusupov,1*GulnaraZh.Yusupova,1*AlbionBaucom,1KateLieberman,1ThomasN.Earnest,2J.H.

D.Cate,3HarryF.Noller1

1CenterforMolecularBiologyofRNA,SinsheimerLaboratories,UniversityofCaliforniaatSantaCruz,SantaCruz,CA95064,

USA.

2BerkeleyCenterforStructuralBiology,PhysicalBiosciencesDivision,LawrenceBerkeleyNationalLaboratory,Berkeley,CA94720,

USA.

3WhiteheadInstitute,Cambridge,MA01242,

USA.

第34页/共118页TheStructuralBasisofRibosomeActivityinPeptideBondSynthesis

Science.2000.289:920-930.PoulNissen,1*JeffreyHansen,1*NenadBan,1*PeterB.Moore,1,2ThomasA.Steitz1,2,3

1DepartmentofMolecularBiophysicsandBiochemistryand

2DepartmentofChemistry,YaleUniversity,and

3HowardHughesMedicalInstitute,NewHaven,CT06520-8114,USA.

*

Theseauthorscontributedequallytothiswork.第35页/共118页RNA组学第36页/共118页RNA组学研究全部非mRNA小RNA的集合人类基因组序列特点：2万2.5万个基因，与蛋白质合成有关的序列占整个基因组的2%左右，其余98%的基因组序列没有得到注释。RNA组学研究范畴（小分子RNA）包括：snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）第37页/共118页NoncodingRNAs(ncRNAs)ineukaryotesSmallRNA(sRNA)inbacteriaSmallnuclearRNAs(snRNAs)SmallnucleolarRNAs(snoRNAs)MicroRNA(miRNA)SmalltemporalRNAs(stRNAs)SmallinterferingRNAs(siRNAs)RNAinterference(RNAi)GuideRNAs(gRNAs)tRNA/mRNA:tmRNA非编码RNA的名称与缩写符号第38页/共118页RNA研究的进步

与RNA技术的发展密切相关第39页/共118页RNA研究相关技术第40页/共118页RNA研究相关技术

RNA技术可以分为：RNA基础研究相关的技术、RNA应用相关的技术、RNA生物信息学技术.

RNA基础研究相关技术包括RNA分离纯化和鉴定技术、RNA与其他生物大分子相互作用技术、RNA高级结构的研究技术和其他相关RNA技术;RNA应用相关技术则包括用于生产其他产品的RNA技术和直接用于药物开发的RNA技术;RNA的生物信息学技术则有各种数据库、非编码RNA的预测、RNA二级结构预测和各种设计软件.第41页/共118页第一节

RNA基础研究相关技术第42页/共118页RNA基础研究相关技术大致可分为四类：RNA分离纯化和鉴定技术、RNA与其他生物大分子相互作用技术、RNA高级结构的研究技术其他相关RNA技术。第43页/共118页RNA分离纯化和鉴定技术

RNA分离纯化和鉴定技术是几乎所有RNA基础研究的基点。（1889年，Altmann第一次分离纯化出不含蛋白质的核酸制品。

1893年，Kossel提出，酵母来源的核酸含有核糖，RNA的研究正式开始。）

现在各种材料的RNA提取和纯化均包括三个步骤：破碎细胞释放其内含物、非RNA物质的去除、RNA的浓缩。

Trizol的技术是目前应用最广泛和最著名的方法之一。对于稀有样本还联合体外转录发展了总RNA扩增技术(cRNA扩增)。第44页/共118页RNA可利用体外转录体系合成利用体外转录体系（invitrotranscriptionsystem）合成RNA是分子生物学常用技术。这种体外转录体系是现代发展起来的体外转录（invitrotranscription）技术——在含有RNA聚合酶（转录酶）、必要的蛋白质因子、核苷三磷酸等条件的体外无细胞体系中，加入DNA模板，模仿体内转录、生成RNA的过程。利用真核细胞核抽提物（nuclearextract）建立再造体系是当前生物技术商家提供体外转录商品试剂盒（kit）的主要来源。第45页/共118页总RNA的分离纯化

总RNA的分离纯化技术已经相当完善，目前和将来的重要发展方向是RNA的进一步分级分离，其中小RNA的分离是研究的热点。目前主要有两种：一是利用电泳根据分子大小分离；二是利用不同浓度的有机溶剂的沉降或吸附效率不同分离。第46页/共118页Trizol技术

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

特点：

1.Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作

2.RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意配带手套，样品尽可能盖严

3.细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA

4.酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分

5.2-8℃避光保存一年

第47页/共118页准备工作

RNA酶（RNase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。

1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套

2.RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求

3.塑料制品、玻璃和金属物品的处理

（1）塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理

第48页/共118页

处理的步骤如下：

在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）

将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃或室温下处理过夜

将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC-H2O处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。

灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用

第49页/共118页（2）玻璃和金属物品250℃烘烤3小时以上

DEPC(二乙基焦碳酸酯)

DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性

DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心

试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性

但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理

第50页/共118页实验步骤

1.取50~100mg的组织,加入1mlTrizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol先放于冰上)

2.将匀浆室温放置5min

3.加入200μl氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3min

4.12000rpm，4℃离心15min

5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中（取400μl），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。）

6.12000rpm，4℃离心15min

7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失

第51页/共118页

8.用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的）

9.8000rpm，室温离心10min

10.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失

11.真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉

12.沉淀用30μlDEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10min

第52页/共118页

13.RNA检测

(1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按

1OD=40μg/mlRNA计算RNA的产量

OD260/OD280在1.8-2.0

(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况第53页/共118页RNA鉴定

RNA鉴定技术，主要是分析RNA的量、大小、丰度、定位、剪切、修饰和序列等信息

纯化的RNA可通过光谱分析和定量分析特定RNA大小最常用的技术是Northern杂交技术，它是由Alwine等在1977年建立的

第54页/共118页核酸定量（DNA或RNA的定量）A260=1.0相当于50μg/ml双链DNA(dsDNA)40μg/ml单链DNA(ssDNAorRNA)20μg/ml寡核苷酸确定样品中核酸的纯度

纯

DNA:A260/A280=1.8

纯

RNA:A260/A280=2.0核酸紫外吸收第55页/共118页衡量特异mRNA丰度方法

经典的衡量某一特异mRNA丰度的方法的有：Northern杂交核糖核酸酶保护定量的反转录PCR

等为研究异质细胞群中RNA和DNA序列的定位，还发展了原位杂交术目前这方面的技术发展方向是大规模化和高通量，其中基因芯片技术有着相当大的优势第56页/共118页RNA加工修饰鉴定技术

有关RNA加工修饰的鉴定技术有多种

其中利用核酸酶对RNA进行作图，定位内含子和外显子；通过核提取物等进行体外剪切分析。最近发展的基因芯片技术可以高通量地分析RNA剪接。

与RNA修饰和RNA编辑研究相关的技术主要有：

snoRNA指导的2‘-O-核糖甲基化修饰鉴定技术假尿苷化修饰鉴定技术

mRNA的各种编辑鉴定技术等第57页/共118页

另外，利用引物延伸法、S1核酸酶法等可以进行RNA末端鉴定。

近年来发展的CAGE(capanalysisgeneexpression)，SAGE(serialanalysisofgeneexpression)等技术可以实现RNA末端大规模鉴定。

其基本原理是在RNA5‘端加上带酶切位点的接头，酶切后可产生带有5’端序列的短片段，经过连接和测序，即可获得大量5‘Tag序列信息。通过分析Taq的频率可同时估计基因的表达情况。第58页/共118页小RNA丰度测定

随着siRNA、microRNA、snoRNA等非编码RNA研究的不断深入，小RNA的分析和鉴定技术也逐步完善。目前有关小RNA丰度测定主要是利用改进反转录PCR技术，常见有三种方案：一、在两端加RNA接头二、通过在3‘端加polyA尾模拟mRNA三、利用stem-loop反转录引物技术

第59页/共118页

前两者同样可用于小RNA文库的构建，之后通过测序，可以获得小RNA的序列信息，在大规模实验的条件下，根据获得的克隆频数也能分析相应的表达水平。也有一小部分小RNA序列是在生物信息学预测的结果基础上进一步验证获得的。

目前，高通量小RNA分析鉴定技术常用的是改进的非编码RNA芯片技术；对于特定的小RNA的分析鉴定除上述技术以外还有改良的Northern技术等。第60页/共118页克隆ncRNA的方法计算机分析法基因克隆法蛋白质-RNA分离法第61页/共118页计算机分析法大致过程：

利用计算机软件从已知基因组序列中寻找基因间区中的snoRNA序列，然后模拟其高级结构，设计引物扩增其序列和克隆，或人工合成其序列，测定其功能。第62页/共118页小RNA的克隆和鉴定小鼠脑组织匀浆总RNA8%PAGE回收50-110nt(fractionI)和110-500nt(fractionII)Poly(A)聚合酶加C尾cDNApSPORT1PCR高密度阵列杂交除去高丰度、已知的小RNA未杂交的cDNA测序详见：http://exppc01.uni-muenster.de/expath/snmrnas.htm第63页/共118页蛋白质-RNA复合物分离法分离蛋白质-RNA复合物，除去蛋白质，纯化RNA分子，反转录成cDNA，克隆，测序，结果分析。

所得RNA的cDNA克隆必须进行Northern杂交，以确认其转录物大小是否相符。第64页/共118页RNA与其他大分子相互作用研究技术

RNA与蛋白相互作用在基因表达调控中发挥着重要作用，相应的技术也与细胞技术和蛋白质技术交叉。通过光交联进行RNA的体外修饰并增加RNP的稳定性，利用凝胶阻滞和硝酸纤维素滤膜结合实验技术分析RNA-蛋白质作用常数，用免疫共沉淀技术分离特异的RNP。

RNA足迹、修饰干扰分析和RNP中寡核苷酸靶向的RNaseH切割保护实验技术也常用于鉴定重要的蛋白质结合位点。第65页/共118页

目前这方面研究也有向大规模发展的趋势，主要有两种方案：

一是在细胞水平利用光交联技术后，通过免疫共沉淀或者其他亲和技术，获取某个或某类蛋白的所有结合RNA基序，进一步通过分离纯化和测序等，获得RNA与蛋白质的相互作用信息。反过来，利用标记的RNA或者已知的RNA结合蛋白也可获得相应与RNA相互作用的蛋白或其他大分子，再通过蛋白质组技术获得相应信息。如RNAi和microRNA作用过程中许多新蛋白的发现就是通过这种技术完成的，从而逐步揭示了细胞内RNA干扰的分子机制。第66页/共118页

二是利用各种文库筛选技术，如酵母三杂交技术、噬菌体展示技术、核糖体展示技术、抑制细菌转录终止检测技术、Northwestern技术等筛选RNA结合蛋白。或反过来通过构建天然或人工RNA文库筛选与蛋白质特异结合的RNA序列。第67页/共118页

RNA与DNA或RNA的相互作用也是基因调控的重要方面

如siRNA或microRNA与靶mRNA的结合，导致靶mRNA的降解或翻译抑制；或者与靶DNA结合指导DNA的甲基化等。从这也衍生出许多相关的实验技术，例如microRNA的实验性寻靶技术。第68页/共118页RNA高级结构研究技术

RNA高级结构、RNA与其结合蛋白的高级结构是RNA研究的重要组成部分。

RNA在体内是以RNP形式存在的，因此研究RNP的结构更具有意义。与之相关技术有各种显微技术、X光晶体衍射技术和磁共振技术等。

（高分辨率核糖体晶体结构的解析、Argonaute蛋白晶体结构的研究等都是这些技术发展的成果，并为RNAi机制的阐明起到巨大帮助。）第69页/共118页其他RNA研究相关技术

在RNA的研究中不可避免的会遇到RNA降解问题，这就需要利用RNA保存技术，这是RNA研究中最基础也是最重要的技术之一。各种RNA工具酶如RNA聚合酶、RNA酶、RNA连接酶和反转录酶的发现，使得进行RNA操作更加方便和容易，从而也促进RNA技术不断创新，应用范围更加广泛。第70页/共118页获得已知序列的RNA分子

无论基础或应用研究中，都有可能需要大量获得已知序列的RNA分子。

RNA合成技术包括：体外转录合成技术直接化学合成技术体内合成技术利用tRNA骨架在体内大量表达出研究者需要RNA分子第71页/共118页第二节

RNA应用相关技术第72页/共118页RNA应用相关技术

虽然RNA的研究蓬勃开展，但是在相当长的时间里RNA还主要停留在基础研究阶段。

直到20世纪80年代末，核酶专利的出现使得RNA应用技术的研究迅速升温。从新RNA应用技术的建立到专利出现的时间差也在不断缩短。

这方面技术也可大致分为两大类：

用于生产其他产品的RNA技术直接用于药物开发的RNA技术。

第73页/共118页

用于生产其他产品的RNA技术主要是指蛋白质合成方面，如蛋白质的体外合成

将RNA的体外合成技术与蛋白质体外合成系统联合在一起可以制备许多生物工程技术不能生产的毒蛋白、人工合成氨基酸掺入蛋白质等

大规模蛋白质体外合成技术必将是今后RNA应用技术发展的一个重要方向

第74页/共118页多聚核蛋白体(polysome)：mRNA与多个核糖体的聚合物——使蛋白质合成以高速度、高效率进行目录第75页/共118页电镜下的多聚核糖体现象目录第76页/共118页rRNA与蛋白质组成核糖体

目录

蛋白质合成场所第77页/共118页核糖体的组成目录原核生物核糖体70SMt2.7×106

真核生物核糖体80SMt4.2×106第78页/共118页直接用于药物开发的RNA技术

目前应用较广泛的主要有：反义核酸(狭义的)技术、核酶技术、SELEX技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)、RNA干扰、引诱物(decoy)技术上述各种技术获得的RNA或DNA及其类似物的作用都是抑制基因表达，因此，这些分子本身可作为各种疾病治疗用的药物许多这方面的药物已经获准上市或处于临床研究阶段第79页/共118页反义核酸技术

1978年，Zamecnik等证明特异互补的寡核苷酸在体外能有效地抑制Rous肉瘤病毒(RSV)增殖。

1984年，Izant和Weintraub等首次提出反义核酸技术(antisensetechnology)的概念。

反义技术：

指根据碱基互补原理，用人工或生物体合成的特异互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰产物)抑制或封闭目的基因表达的技术。

第80页/共118页

广义地讲，反义寡核苷酸技术、反义RNA技术、核酶技术、RNAi技术等都属于反义技术范畴。

目前，传统的反义核酸药物已经发展到了第三代，主要包括肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)、锁定核酸(lockednucleicacid，LNA)等多种化学修饰的寡核苷酸。第一个反义核酸药物(VitravenekTM)已经进入商业市场，还有多种反义核酸进入III期临床试验。第81页/共118页核酶技术

几乎在发现反义RNA的同时,人们发现了一类具有酶活性的单链RNA分子，即核酶(ribozyme)1982年，Cech首先提出Ribozyme的概念，并认为核酶在生物体内普通存在核酶发现的意义：改变了酶的化学本质是蛋白质的传统概念，揭示了RNA在生物体内的多功能特性，RNA既是遗传物质,还具有多功能的催化作用，是生命科学发展过程又一里程碑

第82页/共118页83一些内含子RNA具有自我剪接和催化功能由RNA分子催化自身内含子剪接的反应称为自我剪接(self-splicing)自身剪接内含子的RNA具有催化功能，是一种核酶(ribozyme)

四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式第83页/共118页

核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子。核酶又称核酸类酶、酶RNA、类酶RNA。核酶的功能很多,有的能够切割RNA,有的能够切割DNA,有些还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。

与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。第84页/共118页

核酶技术原理：

核酶RNA分子通过碱基配对原则与靶mRNA结合发挥酶活性，在特定的位点特异性灭活靶RNA分子，同时兼具反义抑制效果。

核酶可以在体外合成，也可以经表达载体导入后在细胞内合成。

脱氧核酶(deoxyribozyme)是近年来发现的一类具有催化活性的单链DNA分子。脱氧核酶兼具ASON反义抑制作用和核酶的靶向性剪切活性等双重优势，而且稳定性较好。第85页/共118页核酶类型到目前为止，人们发现的核酶共有6种类型：I类内含子RNaseP锤头状核酶发夹状核酶丁型肝炎核酶VS核酶

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通过对这6类核酶组成及结构的研究，人们利用锤头状、发夹状、斧头状核酶的特点，人工合成所需要的核酶。锤头状核酶的二级结构是由核酶和底物复合物组成的三个茎环结构。

RNA底物通过二个茎环结合到核酶上，切割位点由一个非配对碱基及与之相连的二个茎环结构组成。切割发生在非配对的3’侧，切割产物5’端是羟基。3`端是一个2’3’环磷酸二酯，核酶催化水解底物需要被水解部有一个特殊的三联密码，NUX、(N{G、A．U；XA、U，C)当三联码为GUC时，被水解的活性最高。第87页/共118页核酶技术的特点①序列特异性；②不编蛋白质，无免疫原性；③可以重复利用，所以研究进展迅速第88页/共118页SELEX技术第89页/共118页SELEX技术

适配分子技术是一种最近发展起来的体外筛选和放大技术，通过该技术可得到一段能与各种目标分子高亲和、高特异结合的核酸序列，该核酸序列称之为适配分子(aptamer)。

Aptamer一词来源于拉丁文Aptus，意即适合的意思(fit)，而这种体外的筛选技术称之为指数级富集配体系统进化技术即SELEX(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)。简言之，Aptamer就是一段核酸序列，它能与相应的配体高特异性和高亲合力地结合。从原始文库中筛选配体相应的Aptamer的技术称为SELEX技术。

Aptamer具有广泛的实用性，它能用于任何以分子识别为基础的诊断和治疗。第90页/共118页原理

从大量的随机序列的寡核苷酸库中鉴定出一种数量很少的具有独特性质的核酸序列的方法是由Tuerk和Ellington等在1990年建立的，它是一种通过体外反复选择和放大从巨大的核苷酸组合库中筛选特定核苷酸序列的方法。

SELEX过程中，首先是用组合化学合成DNA的方法合成随机序列的核酸库，库中的每一个成员是一个线形的寡聚物，库中分子多样性的程度取决于随机寡核苷酸的长度。理论上讲，一个40个碱基的随机序列可有1.2X1024种核苷酸排列顺序(440=1.2X1024)。实际上1μmol的固相DNA合成的随机组合核苷酸库的序列多样性仅限制于1014—1015种，能否找出与靶分子相互作用的稀有序列，很大程度上取决于组合库的多样性，在所有种类的组合随机序列库中寡核苷酸库的多样性最为丰富。

筛选过程中，首先在一定的温度下将寡核苷酸随机序列库与靶分子共同孵育于特定的缓冲液中，组合库中的极少数分子将与靶分子结合，然后用物理的方法将结合的分子与末结合的分子分离开来。标准的方法是将蛋白靶分子固定于硝酸纤维素滤膜上，而其他小的靶分子则固定于固相载体的表面，因此，未与靶分子结合的序列很容易被冲洗掉，而与靶分子结合的序列将被分离出来并放大以获得一个序列库，再对这一序列库进行下一轮的筛选和放大。

第91页/共118页SELEX技术原理第92页/共118页

由于aptamer具有精确识别、易体外合成与修饰等特性，SELEX技术在分析化学、基因调控、蛋白质组研究、疾病治疗与新药研发等方面得到广泛的应用。更重要的是，aptamer的靶分子范围很广，与靶分子间的亲和力和特异性更高，从SELEX技术建立至今，SELEX技术和aptamer的研究不断受到新的挑战与更新。第93页/共118页SELEX技术改良

经过15年的发展，SELEX技术不断得到改进与完善，实现了筛选流程的自动化、筛选形式的多样化、筛选结果的快速化，aptamer也有了多种应用形式。

各种改良SELEX技术：自动化SELEX消减SELEX(subtractiveSELEX)毛细管电泳SELEX(CE-SELEX)加尾SELEX(tailoredSELEX)无引物基因组SELEX(primer-freegenomicSELEX)切换SELEX(togglingSELEX)表达盒SELEX(expressioncassetteSELEX)变构筛选(allostericselection)

利用SELEX技术筛选获得的针对VEGF的RNA配基(aptamer)已经获得美国FDA批准上市，商品名为Macugen，用于老年性视网膜黄斑营养不良(AMD)的治疗。第94页/共118页RNA干扰技术

早在1990年，人们就发现植物中存在转录后基因沉默现象。

1995年，康乃尔大学的Guo在利用反义RNA技术特异性地抑制秀丽新小杆线虫(C.elegans)中的par-1基因的表达时，意外发现对照实验中给线虫注射正义RNA(senseRNA)也能抑制par-1基因的表达。直到1998年，Fire和Mello才首次揭示双链RNA能够特异抑制具有相同序列的靶mRNA的表达，并将这一现象称为RNA干涉(RNAinterference，RNAi)。在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现存在于大多数真核生物中，RNAi技术也被迅速应用到生命研究的各个领域。

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目前，RNAi技术作为基因功能研究和疾病基因治疗的革命性工具，已经在医药开发、基因治疗和功能基因组研究等方面得到广泛应用，并于2006年获得诺贝尔奖。

RNAi技术的作用基础是siRNA的基因沉默作用。第96页/共118页RNA干扰

一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达,促使ｍRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi,也译作RNA干预或者干涉)。第97页/共118页RNA干扰原理第98页/共118页RNAi－一种新的遗传学研究工具RNAi是植物、果蝇、线虫和很可能包括哺乳动物在内的许多生物抵抗病毒感染和限制转座子运动的一种自然存在的防御机制。RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，来制备特定基因缺失表型的个体,从而研究该基因的功能.它正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命,并将彻底改变这个领域的研究步伐,为此被SCIENCE评为2002年最重要的科研成果之一。在哺乳动物细胞中用siRNA(21－23核苷酸长的小分子干扰ＲＮＡ片段(smallinterferingRNAs,siRNAs,又被称为引导RNAs)。能高效阻断某个特定基因的表达,这项技术在疾病的基因治疗上也有光明的应用前景。特别可以用于阻断某些突变基因的表达,或者由蛋白过量表达引起的疾病。第99页/共118页共抑制现象的发现

ＲＮＡｉ研究的早期线索早在20年前,来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组Richjorgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。jorgensen将这种现象命名为共抑制(cosuppression),因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象,后来发现在其他许多植物中,甚至在真菌中也有类似的现象。

第100页/共118页第101页/共118页基因沉默

转录阶段基因沉默(transcriptionalgenesilencing,orTGS)：

对于部分植物来说,转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致,这被称为转录阶段基因沉默.转录后发生的基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,orPTGS)：Ｈａｍｉｌｔｏｎ等,率先在发生ＰＴＧＳ的西红柿中检测出与被沉默基因同源的约25ｎｔ的短片段ＲＮＡ,而未发生ＰＴＧＳ的西红柿则不能检出25ｎｔ的ＲＮＡＨａｍｉｌｔｏｎＡＪｅｔａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ,1999,286(5441):950—952

第102页/共118页第103页/共118页第104页/共118页

目前在体内或体外RNAi中应用的siRNA主要有两种来源：体外化学合成或转录的siRNA和利用DNA载体在细胞内转录产生。由化学合成或体外转录的方法得到~21nt的siRNA，目前应用得最广泛。尤其是经过修饰后提高稳定性的siRNA仍可表现特异的基因沉默作用，为其在体内的应用提供了可能的前景，而且目前的研究表明，无论在细胞或动物体内，应用此类siRNA均不影响体内miRNA的表达和功能，进一步说明siRNA应用的可靠性。

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也有根据靶基因mRNA设计的长dsRNA经Dicer剪切成一系列~21nt的siRNA(统称为esiRNA)，能更有效、更方便地抑制基因的表达，但是其缺点是可能存在非特异效应。随着miRNA研究的不断深入，人们发现根据miRNA设计的发夹RNA，或基于