PCR技术在乙肝方面的应用

PCR技术在乙肝方面的应用第1页/共55页HepatitisBVirus乙型肝炎的病原体在全世界广泛流行，估计全球半数以上人口已被HBV感染过。中国：乙肝高发区，人群HBsAg的检出率达9.8%第2页/共55页乙型肝炎病毒感染的现状全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是乙肝携带者高于人群的10％。急性乙肝中有20%会转为慢性，进而可能发展为肝硬化和肝癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。第3页/共55页第4页/共55页乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），基因组长度3.2kb

目前感染人类最小的DNA病毒部分双链环状DNA。

第5页/共55页HBV基因及编码蛋白第6页/共55页HepatitisBVirus第7页/共55页第8页/共55页乙肝的实验室诊断

（一）生化学检查（二）HBV血清学检查（三）HBVDNA、基因型和变异检查第9页/共55页生化学检查ALT和AST血清胆红素凝血酶原时间（PT）及PTA胆碱酯酶血清白蛋白甲胎蛋白（AFP）第10页/共55页生化检测的局限性敏感度有限代表肝细胞损害，水平高低不能代表肝储备能力关于“胆酶分离”现象第11页/共55页HBV血清学检查项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBcIgM方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性)发光免疫分析(定量)第12页/共55页HBsAg

–

感染的标志Anti-HBs–

既往感染/接种疫苗Anti-HBcIgM

–

急性感染标志Anti-HBcIgG

–

既往或慢性感染HBeAg–

急性病毒复制，有传染性

Anti-HBe–病毒不再复制HBV-DNA

–

急性病毒复制，比HBeAg更准确；主要用于监测治疗反应第13页/共55页血清学检测的临床意义HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义

急性或慢性感染(大三阳)+-+-++++乙肝后期或慢性感染(小三阳)--++---潜伏期或急性乙肝早期--+++痊愈或恢复期,有免疫力-----+++--痊愈,有免疫力疫苗接种或曾经感染过,有免疫力第14页/共55页血清学检测的局限性HBV具有“检测窗口期”假阴性结果无法检测突变株及抗体第15页/共55页SymptomsHBeAganti-HBeIgGanti-HBcIgManti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100AcuteHBVInfectionwithRecoveryTypicalSerologicCourseWeeksafterExposureTitre第16页/共55页IgManti-HBcIgGanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652YearsWeeksafterExposureTitreProgressiontoChronicHBVInfectionTypicalSerologicCourse第17页/共55页第18页/共55页PCR技术检测HBVDNAPCR聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。第19页/共55页第20页/共55页PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2小时完成扩增对标本的纯度要求低

DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板第21页/共55页PCR反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94C

30s

退火（annealing）:55C30s延伸（extension）:72C30-60s

3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。第22页/共55页第23页/共55页第24页/共55页普通PCR技术的缺点普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。

第25页/共55页定量PCR的特点

采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染。避免了假阳性。探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性。第26页/共55页定量PCR的特点可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性。第27页/共55页HBVDNA检测方法的比较

斑点杂交PCR定量PCR敏感性低

较高

高特异性高稍低高重复性好稍差好定量范围

466简便较繁琐简便简便安全性好稍差好设备便宜稍贵昂贵技术要求低高高检测价格低中高第28页/共55页

为什么建议每个病人都要进行HBVDNA检测？第29页/共55页

HBVDNA检测的临床意义⒈诊断方面：⑴HBVDNA是HBV存在最直接的依据⑵HBVDNA是HBV复制的标志⑶HBVDNA是患者具有传染性的标志第30页/共55页HBVDNA检测的临床意义

⑷对HBV-M起补充作用：①HBeAg(﹣)/抗HBe(﹢)乙型肝炎（前C区变异）②HBsAg(﹣)乙型肝炎（S区变异）③低水平感染单项抗HBc(﹢)乙型肝炎

第31页/共55页HBV基因及编码蛋白第32页/共55页HBVDNA检测的临床意义

⒉疗效判断：

HBVDNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标

⒊预后判断

HBVDNA水平与病情有一定的关系第33页/共55页

HBV-M与HBVDNA关系

广东四川湖南解放军南方医院

“大三阳”

86.2﹡85.087.394.3893.4“小三阳”

35.120.325.627.323.8“

小二阳”

40.727.648.838.5630.5

抗HBc11.510.819.3

抗HBs3.609.70

三抗体阳5.01.110.0

全阴04.0调查总例数14742828814838773＊HBVDNA阳性率第34页/共55页HBVDNA检测的临床意义

调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBVDNA来决定。第35页/共55页HBV-DNA定量检测的临床应用慢性乙肝诊断治疗监测和疗效评价跟踪随访预后判断第36页/共55页HBV-DNA定量—

慢性乙肝的诊断HBsAg阳性六个月以上ALT持续升高或反复升高HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）第37页/共55页HBV-DNA定量—

慢性乙肝的治疗监测治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV-DNA）治疗开始后前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA，对于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级，可以认为治疗有效第38页/共55页HBV-DNA定量—

治疗后的随访无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每3～6个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBVDNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。第39页/共55页HBV拉米夫定耐药虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67%一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹第40页/共55页

YMDD变异YMDD酪氨酸－蛋氨酸－天门冬氨酸－天门冬氨酸。如发生YMDD变异，则其中的蛋氨酸（M）突变为异亮氨酸（isoleucine，I）或缬氨酸（valine，V）形成YIDD变异株或YVDD变异株

。YMDD位于HBV多聚酶的关键功能区。第41页/共55页YMDD变异检测采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检测出现的突变类型（YVDD或YIDD），而且能够确定突变株所占比例，对及时调整治疗方案具有非常重要的意义能够准确稳定的检测到1%的突变株，能够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案第42页/共55页HBV拉米夫定耐药突变检测原理PrimerFPrimer

FPrimer

FProbeProbeProbePrimer

HBVPrimer

YIDDPrimer

YVDDHBV检测I突变检测V突变检测第43页/共55页什么时候开始检测YMDD变异

拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况治疗时间HBVDNA大于104copies/ml例数YMDD变异例数*<6个月 6 1（17%）6~12个月 26 14（54%）12~24个月 38 26（68%）24~36个月 38 38（100%）*各组之间两两比较均有显著差异（P<0.05）。第44页/共55页YMDD变异株的动态变化第45页/共55页YMDD变异株的动态变化第46页/共55页YMDD检测应用方法对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测治疗前检测一次（约有10-20%的人在治疗前就有YMDD变异）治疗开始后第七个月开始，每三个月检测一次第47页/共55页慢性乙肝的基因分型乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序列的差异可以分为A～H八种亚型，我国以B型（41%）和C型（53%）为主不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型对肝的损伤比B型严重，基因型C比基因型B更容易发展成为肝硬化不同的基因型对药物的应答也不一样：基因型B比基因型C对干扰素治疗更敏感第48页/共55页共价闭合环状DNA(cccDNA)检测HBVcccDN