怎样选择色谱柱

如何选择色谱柱现代高效液相色谱中，分别成效利害很大程度上取决于色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，要做适合的选择，一定对此有必定的认识和认识。1、正相色谱正相色谱用的固定相往常为硅胶（Silica），以及其余拥有极性官能团，如胺基团(NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。因为硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其余团的极性较强，所以，分别的序次是依照样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最初被冲刷优秀谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对照固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿Chloroform）,二氯甲烷（MethyleneChloride）等。2、反相色谱反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，往常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混淆物。样品流优秀谱柱的次序是极性较强组合最初被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保存。常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。二、聚合物填料聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要长处是在PH值为1～均可使用。相对与硅胶基质的C18填料，这种填料拥有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分别特别有效。此刻的聚合物填料的弊端是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。三、其余无机填料其余HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。因为其特别的性质，一般仅限于特别的用途。如石墨化碳也用于正渐渐成为反相色谱填料。这种填料的分别不一样与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保存的基础，不再需其余的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保存能力更强，石墨化碳可用于分别某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这种柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳固的色谱柱柱床，其长处是可在PH高达12的流动相中使用。但因为氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围遇到必定的限制，所以未能宽泛应用，新式氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应PH范围1～14，温度可达100℃。因为氧化锆填料几年才开始研究，加之面对的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。如何选择填料粒度当前，商品化的色谱料粒度从1um到超出30um均有销售，而当前剖析分别主要用3um、5um和10um填料，填料的粒度主要影响填补柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料应用，在同样选择性条件下，提升柱效可提高分别度，但不是独一的要素。假如固定相选择是正确，可是分别度不够，那么选择更小粒度的填料是很实用的，3um填料填补柱的柱数比同样条件下的5um填料的柱效提升近30%；但是，3um的色相谱的背压倒是5um的2倍。与此同时，柱效提升意味着在同样条件下能够选择更短的色谱柱，以缩短剖析时间，此外，能够采纳低粘度的溶剂做流动相或增添色谱柱的使用温度，比方用乙腈取代甲醇，以降低色谱柱的压力。一、如何保证优秀的柱性能与柱寿命◆认证阅读色谱柱使用说明书；◆使用填补优秀的色谱柱；◆尽量减少压力颠簸，防止机械及热冲击；◆使用保护柱及在线过滤器；◆常常以强溶剂冲刷色谱柱；◆充分过滤样品及流动相，尽量防止杂质微粒与强保存成分；◆用稳固的固定相（C18最稳固）；◆在中等PH值操作（6~8），用有机缓冲溶液；◆色谱柱使用温度最好小于40℃；◆硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0；◆在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；◆流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不可以低于5%；◆留宿或储存时，冲刷掉盐缓和冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴最好）。HPLC名称Silica

固定相及应用范围又名功能基团

-OH

正相

反相

离子对√

应用

非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。SASC1-(CH3)3√在全部的烷基键合相中对非极性化合物保存最弱，典型用于中等极性和多官能团化合物.ButylC4-C4H9√√分别肽和蛋白质，保存时间比C8和C18短。MOSC8，-C8H17√√中等极性相中对中等化合物，小肽和蛋白质，Octyl极性药族化合物和环境样品。ODSC18-CH37√√烷基键合相中对中等极性18化合物保存最强。广泛用于药物，甾族化合物，脂肪酸和环境样品.CPSCN,Cyano-(CH)CN√√对极性化合物有独到的选择性，适23合应用于正相(propyl分别，当用于反相系统时，其选择性与C8和Nitrile)C18不一样，在药学领域和复杂混淆物的分别中应APS

NH2

-(CH2)3NH2

√

√

用宽泛。反相中剖析糖类和其余极性化合物。弱阴离子交(AminoPropyl)

换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性剂做流动相。正相中与硅胶的选择性机改性剂不一样,剖析芬芳族成效很好。PhenylDiol

-(CH3)C6H5-(CH2)2O

√√芬芳族化合物√√反相时，分别肽和蛋白质。正相时，与硅选择SCXSAX

强阳离子互换强阴离子互换

CH2(CH2OH)2-(CH2)2C6H4SO3H--(CH2)3N+(CH3)3

性相像,但极性较弱。√有机碱有机酸，核苷和核苷酸二、如何解决色谱柱使用过程中出现的问题1.保存值与分别度重现性不好原由剖析问题

原由

表现不一样色谱柱间差别

填料、键合相不一样

保存因子（

k），分别因子（α）使用时期柱变化

柱床损坏

柱效（N）键合相丢掉

保存因子（k），分别子（α）硅胶基质溶解

柱效（N）强保存分聚积拥塞

保存因子（

k），柱效（

N）柱外效应

系统差别，进样量大、柱效（N）进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。分别成效变差

流动相组分改变

保存因子（

k），柱效变化很小流速改变

保存因子（

k），分别因子（α）温度改变

保存因子（

k），柱效变化很小柱均衡慢柱超载

从头均衡时间不够样品量太大

保存因子（k），柱效变化很小保存因子（k），柱效（N）造成色谱峰（不对称）拖尾的原由1.色谱柱自己填装问题，筛板拥塞或填料塌陷；2.柱头有污染；样品超载；样品溶剂不适合；5.柱外效应；化学或二次保存（硅羟基）效应；缓冲容量不足或不适合；重金属污染。3.如何解决峰形拖尾的问题A．与化学有关的拖尾问题1．流动相中，加入30mM的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸胺（用与酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺；2．如仍旧拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；3．降低进样量至<1ug。B．与色谱柱有关的拖尾问题1．如柱头处有强保存的样品组分聚集，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲醇，加1%氢氧化铵混淆液冲刷，正向柱可用甲醇冲刷。2．使用保护柱C．与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽1．进样体积过大，（往常≤25uL）；2．进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（最正确连结收应<20cm，内径0.007″）；3．检测器流通池的体积过大。4．如何储藏色谱柱1．防备缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以克制细菌成长（必定小心其毒性和潜伏的爆炸性）；或在流动相中加20%的有机改性剂，也可克制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。2．尽可能将色谱柱储存于100%有机溶剂（乙晴最好）中，防止在缓冲溶液中保存。3．使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15～20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲刷色谱柱，后换成100%有机溶剂储藏。4．防止用纯净水冲刷键合致密的C18柱。5．将色谱柱的两头用堵头拧好，免得柱床填料干裂。如何选择保护柱如何选择保护柱，但又不可以影响分别剖析？这是色谱工作者常常提出的一个问题。往常，在选择保护柱以前第一要考虑的是样品能否洁净。关于大多半剖析工作者来说，一只1cm长的保护柱，那么就应选择2cm或3cm长的保护柱。保护柱越长，自然所装填的色谱填料就越多，则其越能防止污染物进入剖析色谱柱的时机。自然，跟着保护柱的长度加长，样品的保存时间会比使用短保护柱长。一般来说，保护柱的内径与剖析色谱柱的内径同样或相立即可。保护柱的填料装填方式也很重要。当前有薄膜装填法的保护柱，使用过程很简单方便，并且能够在实验室中进行干装。可是，其最大的弊端是不经济，特别是针对中国的详细状况，一次性使用相对花费较高。此外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限，只好供给有限的保护作用；可是也因为所装填的色谱料较少，保护柱的长度也较短，所以对剖析样品的保存时间的影响也很小。另一种保护柱构造其实质是缩短了的色谱剖析拄，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱的生产厂商直接安装在色谱剖析柱上的，一定与色谱剖析柱一起订货，能够特别方便地使用，但不可以够被改正。直连式构造设计可在任何时候有色谱工作者来安装连结，能够与任何品牌的色谱剖析柱连结使用，并且还能够依据样品的有关状