分子生物学第五章原核转录

中心法则1954年首次提出的“中心法则”1970-1980年的“中心法则”21世纪后修正的“中心法则”当前1页，总共44页。转录相关的一些概念转录：在RNA聚合酶的作用下，以一段DNA链为模板合成RNA，将DNA携带的遗传信息传递给RNA的过程。其后果是合成一条鱼DNA链序列完全相同（除T/U）的RNA单链。当前2页，总共44页。编码链（codingstrand）：与mRNA序列相同的DNA链称为编码链，又叫有义链（sensestrand）。模板链（templatestrand）：根据碱基互补的原则指导RNA合成的DNA链称为模板链，又叫反义链（antisensestrand）。当前3页，总共44页。转录的基本特点1. 转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。

模板链并非永远在同一条单链上

当前4页，总共44页。转录的方向性：RNA聚合酶与DNA聚合酶聚合方向一样是5-3方向，模板是3-5方向。转录有起始和终止位点：

转录单元：可被RNA聚合酶转录成完整的RNA的一段DNA序列包括启动子和终止子；一个转录单元可能包括多个基因(?)原材料：NTPs当前5页，总共44页。AtranscriptionunitisasequenceofDNAtranscribedintoasingleRNA,startingatthepromoterandendingattheterminator.

当前6页，总共44页。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为嘌呤。在原核中90%为嘌呤，A或G；把起点5’末端的序列称为上游（upstream），把其3’末端的序列称为下游（downstream）。当前7页，总共44页。转录与复制的比较相同点：体现在酶学和化学上，反应的方向，以DNA为模板，起始延伸终止三阶段；不同点：不同点聚合酶；不同的底物；转录不需要引物，能够起始新链的合成，而且保留5‘端3磷酸；产生的RNA不需要与DNA模板结合；正确率比复制低；转录对某个基因的重复的转录，产生多个拷贝，复制1：1；终止方式当前8页，总共44页。RNA聚合酶RNA聚合酶是催化RNA合成的大分子：RNA聚合酶的反应条件需双链DNA模板;转录时，按5’3’方向合成RNA链；以4种NTP（A，U，G，C）为底物；不需引物，能够起始新链的合成，而且保留5‘端3磷酸。当前9页，总共44页。当前10页，总共44页。2.2原核生物中的RNA聚合酶原核生物中由一种RNA聚合酶催化所有RNA(mRNA,rRNA和tRNA)的合成。

核心酶：2，β；β’；ω亚基RNA聚合酶全酶

σ亚基：启动子的识别RNA聚合酶是目前已知的最大的酶之一。当前11页，总共44页。当前12页，总共44页。大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因分子量亚基数组分功能αrpoA365002核心酶核心酶组装，启动子识别βrpoB1510001核心酶β和β‘共同形成RNA合成的活性中心，形成磷酸二酯键β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶与DNA模板结合σrpoD700001σ因子存在多种σ因子，用于识别不同的启动子当前13页，总共44页。核心酶与DNA序列结合是随机的，平均结合常数是2×1011；全酶因为包含σ亚基与特异序列（启动子）的结合能力提高，降低与随机序列结合的能力。核心酶与全酶的区别当前14页，总共44页。RNA聚合酶RNApolymerasescomeindifferentforms,butsharemanyfeaturesRNApolymerasesperformsessentiallythesamereactioninallcells1.识别启动子，核心酶通过结合不同的σ因子能够识别不同的启动子2.结合DNA使之解链，并具有解旋和重新螺旋化DNA的作用3.RNA聚合作用4.识别转录终止信号5.与转录因子相互作用调节转录速度6.在转录受阻时候进行自身调整，借助辅助因子回复和维持RNA的合成BacteriahaveonlyasingleRNApolymeraseswhileineukaryoticcellstherearethree:RNAPolI,IIandIII当前15页，总共44页。在某些细菌中含有识别不同启动子的σ因子，以适应不同生长发育阶段的要求，控制不同基因转录的起始。当前16页，总共44页。RNApolymerases的亚基当前17页，总共44页。细菌RNApolymeraseThecoreenzymealonesynthesizesRNAaabb’w当前18页，总共44页。aab’wRPB3RPB11RPB2RPB1RPB6相同的颜色代表两个酶的同源区原核生物真核生物b当前19页，总共44页。“Crabclaw”shapeofRNAP

(TheshapeofDNApolis__)Activecentercleft当前20页，总共44页。启动子的结构和功能启动子是一段位于结构基因5’端上游区的保守的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子位于转录起始位点（+1）上游，因此不被转录。当前21页，总共44页。-10区的发现1975年，Pribnow和Schaller将RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNaseI降解DNA，得到41～44个核苷酸对的DNA片段。序列分析发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的保守序列，是聚合酶结合位点，称为Pribnow区，其中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为–10区。当前22页，总共44页。其保守序列为TATAAT，位于-10bp左右，其中3′端的“T”十分保守。A.T较丰富，易于解链。它和转录起始位点I一般相距5bp。当前23页，总共44页。-35区的发现提纯被保护的片段后却发现，RNA聚合酶并不能重新结合或并不能选择正确的起始点，表明在保护区外可能还存在与RNA聚合酶对启动子的识别有关的序列。从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SV40启动子的–35bp附近找到了另一段共同序列：TTGACA。与-10区序列相隔16-19bp。当前24页，总共44页。-10区和-35区在转录起始中的作用利用定点诱变技术突变启动子，研究-10、-35区的功能。结果：-10区的突变不影响RNA聚合酶与启动子的结合速度，但是降低双链DNA解链速度；-35区的突变降低RNA聚合酶与启动子的结合速度，但是不影响降低双链DNA解链速度。结论：-10区有助于dsDNA解开，-35区有助于启动子与DNA聚合酶全酶的结合（sigma因子介导）。当前25页，总共44页。－10区和－35区的最佳距离在原核生物中，－10区和－35区的最佳距离大约是16～19bp，17bp转录效率最高，约2个螺距，过大或过小都会降低转录活性。-10区和-35区之间的序列不重要，关键是距离。可能与RNAPol本身的大小和空间结构有关。当前26页，总共44页。结构典型，都含有识别（R），结合（B）和起始（I）三个位点；序列保守，如-35序列，-10序列结构都十分保守；位置和距离都比较恒定；直接和多聚酶相结合；常和操纵子相邻；都在其结构基因的5端；决定转录的启动和方向。当前27页，总共44页。转录过程-起始（Initiation）转录起始：RNA聚合酶与dsDNA的结合启动子：位于结构基因5’-端上游区的DNA序列，能够活化RNA聚合酶，使之与模板准确结合转录起始位点：新生RNA链第一个核苷酸对应的DNA上碱基，+1当前28页，总共44页。转录开始的部位记做+1，称为转录起始点；与复制起始点（ori）不同，ori为一个区域，转录起始点为一个碱基；与转录相同的方向为下游，标记为+1，+2，+3……，与转录相反的方向为上游，标记为-1，-2，-3…；转录的位点没有0。当前29页，总共44页。起始阶段三步骤：1. 封闭二元复合物closedcomplex2. 开放二元复合物opencomplex3. 稳定三元复合物Stableternarycomplex当前30页，总共44页。RNA聚合酶含盖在起始点的上游70bp处，这种结构由DNA、RNA聚合酶构成，叫做二元闭合复合体。当DNA双链变成单链时，称为二元开放复合体，这个阶段是不可逆的。解旋区域：－9---＋13。转录泡。聚合酶全酶的σ因子从复合物上释放，合成9nt的RNA，由RNA聚合酶-DNA-新生RNA形成的复合物为三元复合物。此时RNA聚合酶一直处于启动子区，转录进入延伸阶段。当前31页，总共44页。Transcriptionbubble当前32页，总共44页。三元复合物的去向流产式起始：合成并释放2—9个核苷酸的短RNA转录物；形成转录延伸复合物：尽快释放亚基，而后尽快通过上游启动子区，延伸RNA链至完成转录。转录的起始与转录的频率：转录起始后RNA聚合酶通过启动子的时间代表该启动子的强弱，启动子强，通过的时间短，转录频率高；反之转录频率低。当前33页，总共44页。转录过程-延伸（Elongation）RNA聚合酶沿模板DNA移动，按照5’－3’方向合成RNA链的过程。RNA聚合酶覆盖35--40bp区域，解旋区域大概是17bp，RNA合成时与DNA形成DNA－RNA杂合体，DNA重新螺旋之后，RNA被挤出DNA－RNA杂合体，仅在3‘端有20—30nt与酶或DNA结合。当前34页，总共44页。原核生物的RNA聚合酶（核心酶）按照5’－3’方向延伸RNA链，解旋区域也随之移动，即边解旋，边合成，边重新螺旋。当前35页，总共44页。转录过程-终止（Termination）RNA聚合酶延伸到终止位点时，转录结束，包括转录泡瓦解，RNA聚合酶和DNA、RNA分开等。终止子即转录终止位点，即提供终止信号的DNA序列。根据终止作用是否需要ρ因子（释放因子，是实现终止作用的蛋白质辅助因子），可以分为：

不依赖ρ因子的终止子（强终止子）

依赖于ρ因子的终止子（弱终止子）当前36页，总共44页。不依赖因子的终止子终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构；在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，RNA的3’端为寡聚U。发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。当前37页，总共44页。结合最弱的碱基配对A:U

解链更容易终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度长效率高当前38页，总共44页。依赖于因子的终止子因子：六聚体蛋白，具有NTP酶活和解螺旋酶活，能水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。各亚基具有ATPase结构域和RNA结合域。当前39页，总共44页。RhofactorpursuesRNApolymerasealongtheRNAandcancauseterminationwhenitcatchestheenzymepausingatarho-dependentterminator.Howdoesrhofactorwork?当前40页，总共44页。依赖于因子的终止子作用机制该类终止子也有回文区，但是不富含GC，回文结构后无寡聚U序列，主要存在于噬菌体，细菌中少见；因子结合于转录物终止位点上游新生RNA链的5‘端的装载位点，6个亚基组成六聚体；结合RNA之后激活ATPase活性，水解ATP推动因子六聚体沿RNA5-3方向靠近转录泡，速度比RNAPOL快；当RNA聚合酶到达终止子区域，转录产物形成发夹结构，使RNApol暂停延伸，因子追上转录泡；终止子与因子共同作用使转录终止；因子的RNA-DNA解螺旋酶活性使转录产物从DNA模板上释放出来。当前41页，总共44页。抗终止阻止或影响终止子的形成或作用，使RNA聚合酶能够顺利通过该区域继续转录。破坏终止位点RNA的茎-环结构；

色氨酸操纵子依赖蛋白质因子的转录抗终止。当前42页，总共44页。Thetrpleaderregioncanexistinalternativebase-pairedconformations.Thecentershowsthefourre