HXY基因工程概述

HXY基因工程概述第1页/共100页《基因工程》总目录第一章基因工程概述第二章基因工程的载体和工具酶第三章基因的常规技术第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达第五章转基因植物第六章转基因动物第七章基因治疗（选讲、自修）第八章蛋白质工程（选讲、自修）第2页/共100页考核方法平时成绩30%闭卷考试70%名词解释出勤课堂课堂表现小综述填空题选择题100%判断题问答题第3页/共100页主要参考资料张惠展等.基因工程(第2版).高等教育出版社吴乃虎等.基因工程原理.科学出版社。•生物技术通报•中国生物工程杂志•农业生物技术学报•生物工程学报•生物技术•遗传•Moleculargeneticsandgenomics

•Animalbiotechnology•Naturegenetics•

Plantcell

•

Science•

Nature第4页/共100页小综述推荐内容和写作要求1.每人从中任意选择一个大题目（也可以自己另选一个题目），或在大题目下自己立一个分题目，但不能与其他人重复。2.每个题目都要写出原理、产生、发展历史、现状、发展趋势、理论或实践意义。3.A4纸打印。第5页/共100页推荐小综述题目1.单色和多色荧光原位杂交（FISH）2.RNA干扰（RNAi）及其应用

3.生物芯片（chip）4.基因扩增（PCR）5.基因库（genebank）及序列的查询和分析6.DNA测序7.酶联免疫吸附测定（ELISA）8.遗传病的基因治疗

9.噬菌体展示

（phagedisplay）

第6页/共100页10.酵母双杂交及其衍生系统

11.基因疫苗

12.基因打靶

（genetargeting)13.随机多肽文库（RPLs）

14.转基因植物

14.转基因植物

15.转基因动物

16.定点突变

17.细菌表面呈现（Bacterialsurfacedisplay）

18.动物克隆

19.胚胎干细胞（ESC）

第7页/共100页21.内含肽（intein）及其应用

20.差异显示

22.限制性内切梅

23.基因工程载体

24.生物软件及其使用25.基因工程相关的网站26.人类基因组计划（HGP）27.基因工程产物的纯化策略（载体）28.基因工程对中国经济的影响第8页/共100页30.基因工程的社会安全及伦理问题29.发达国家中的基因工程发展及现状31.制作基因工程网站32.目前流行的传染性疾病的基因工程治疗思考33.核糖体展示技术（ribosomedisplay）第9页/共100页第一章基因工程概述第10页/共100页1.1基因工程的发展简史在分子水平上，提取或合成不同生物的遗传物质，在体外进行切割、再和某一载体进行拼接重组，然后再将重组的DNA导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。简单说：指异源重组DNA在受体细胞的扩增与表达。

DNA重组、扩增、表达是其三要素。一、基因工程的概念第11页/共100页生物工程biologicalengineering遗传工程geneticengineering基因工程geneengineering分子克隆molecularcloning基因克隆genecloning基因操作genemanipulation重组DNA技术recombinantDNAtechnique基因工程(geneengineering)常和以下名称混用:第12页/共100页

基因工程的诞生和发展泛基因阶段1

顺反子阶段4

摩尔根的基因阶段3

孟德尔遗传因子阶段2

现代基因阶段

5基因的研究第13页/共100页MendelG.J.(1822-1884).1856-1864豌豆杂交实验。2.Mendel的遗传因子阶段第14页/共100页1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律1900年Mendel遗传规律被重新发现。遗传学的元年Mendel提出：生物的某种性状是由遗传因子负责传递的。是颗粒性的，体细胞内成双存在，生殖细胞内成单存在。遗传因子是决定性状的抽象符号。第15页/共100页孟德尔分离律第16页/共100页孟德尔自由组合律

黄圆绿圆黄皱绿皱第17页/共100页1909年丹麦遗传学家Yohannsen(1859-1927)发表了“纯系学说”首先提出了“基因(gene)”的概念，代替了Mendel“遗传因子”的概念。但没有提出基因的物质概念。3.Morgan的基因阶段第18页/共100页

显微镜技术与染色技术的发展，使人们注意到，细胞分裂时，尤其是减数分裂中，染色体的行为和孟德尔提出的等位基因的分离规律相当一致，所以，确定基因在细胞核中，在染色体上。第19页/共100页1910年，MorganT.H.等以果蝇为研究材料，提出了基因的连锁遗传规律。说明了基因是在染色体上占有一定空间的实体。基因不再是抽象符号，被赋予物质内涵。连锁遗传规律的提出第20页/共100页第21页/共100页第22页/共100页4.顺反子阶段1957年，本泽尔(SeymourBenzer)以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）概念。

顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1条多肽链。第23页/共100页5.现代基因阶段

1）操纵子

（启动基因＋操纵基因＋结构基因）第24页/共100页2）跳跃基因

指DNA能在有机体的染色体组内从1个地方跳到另一个地方，它们能从1个位点切除，然后插入同一或不同染色体上的另一个位置。3）断裂基因

1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为断裂基因。4）假基因

不能合成出功能蛋白质的失活基因

。5）重叠基因

不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的即重叠的。现代对基因的定义是：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。

第25页/共100页基因的特点

:不同基因具有相同的物质基础基因是可以切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代第26页/共100页二、基因工程诞生的理论基础1.DNA是遗传物质1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA。1944年

Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。（1）肺炎双球菌转化实验（2）噬菌体转染实验第27页/共100页

1928年，英国微生物学家F.Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。

（1）S型：注射小白鼠，死亡。（2）S型，65℃加热：注射小白鼠，活。（3）R型：注射小白鼠，活。（4）65℃加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。

第28页/共100页40年代，DNA是遗传物质被证实1944年，美国洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。（1）S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；（2）经DNase处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。（3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。第29页/共100页第30页/共100页第31页/共100页第32页/共100页1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。2.DNA双螺旋结构第33页/共100页50年代，DNA的双螺旋模型的提出和DNA复制机理的阐明

DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。

1953年，FrancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。

第34页/共100页第35页/共100页分子遗传学的诞生第36页/共100页1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”

DNA

RNA

protein1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码3.中心法则和遗传密码第37页/共100页第38页/共100页原核生物的基因调控操纵子模型1961年，JacquesMonod和FancoisJacob提出了原核基因调控的操纵子模型（operonmodel）。第39页/共100页三、基因工程诞生的技术突破1.限制性内切酶（restrictionendonucleases）1970年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。WernerArber理论预见限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断HamiltonO.Smith得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖第40页/共100页2.DNA连接酶（ligase）1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。3.载体（vector）1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。4.感受态体系1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。第41页/共100页5.琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。6.DNA测序技术1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术。1980年Nobel化学奖第42页/共100页四、基因工程的诞生1980年Nobel化学奖1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：1.Berg的开创性实验将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来。第43页/共100页2.Boyer-Cohen实验1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。第44页/共100页Boyer-Cohen实验第45页/共100页StanleyCohen1986Nobel生理或医学奖HerbBoyer第46页/共100页外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。1.跨物种性2.无性扩增外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。五、基因工程的特征第47页/共100页2.重组体的制备六、基因工程的主要操作内容1.目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。第48页/共100页将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定3.重组体的转化挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。第49页/共100页基因工程的基本流程基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞第50页/共100页51基因工程的基本过程酶切连接载体目的基因重组子宿主细胞选择、筛选目的基因扩增转化或转染目的基因表达导入表达体系第51页/共100页基因工程研究的基本技术路线

第52页/共100页1.2基因工程的兴起1977年，激素抑制素的发酵生产成功。1978年，Goeddel等，人胰岛素的发酵生产成功。1979年，Goeddel等，又在大肠杆菌中成功表达了人生长激素基因。1980年，Nagata等，遗传工程菌生产干扰素获得成功。1981年，用遗传工程菌生产的生物制剂包括动物口蹄疫疫苗、乙型肝炎病毒表面抗原及核心抗原、牛生长激素等。1982年，重组DNA技术生产的药物-人胰岛素进入商品化生产。1983年，基因工程生产狂犬病疫苗取得突破型进展。第53页/共100页1997年，动物基因工程产品销售额约1.8亿$转基因小鼠人类秃顶NatureBiotechnology,1999,17(1):9转基因家蚕防弹衣NatureBiotechnology,1999,17（5）：412第54页/共100页‘83‘84‘85‘86‘87‘88‘89‘90‘91‘92‘93‘94‘95‘96‘97‘98‘99‘00‘01‘02FirsttransgenicplantDelay-ripeningtomatoCommercializedintheUSFirst

field

testsHerbicideresistant,insectresistantplantscommercializedGMmaizeapprovedbyEUFirstBtcornplantsRottingresistanttomatoapprovedbyFDA植物基因工程的发展迅速第55页/共100页植物转基因育种的发展优势1、扩大了作物育种的基因库

2、提高了作物育种的效率

3、减轻了农业生产对环境的污染4、拓宽了作物生产的范畴

第56页/共100页全球转基因作物种植面积（百万公顷）

第57页/共100页全球转基因作物导入特性比例

第58页/共100页全球不同转基因作物和应用面积第59页/共100页全球转基因作物销售收入（亿美元）

第60页/共100页植物基因工程研究植物基因组计划植物分子育种高产、优质、高效和多抗性植物作为反应器香蕉、马铃薯、番茄等玉米、棉花、大豆、高粱和番茄酒精、石油、工业酶等第61页/共100页我国基因工程部分研究进展转基因抗病虫植物我国科学家将抗虫基因导入棉花，获得了抗虫植株，对棉蛉虫的抗虫效果十分显著，现正进行田间加代繁殖。抗黄矮病、赤霉病、白粉病转基因小麦和抗青枯病马铃薯也已研究成功，开始田间加代繁殖。基因工程疫苗乙型肝炎是危害我国人民健康的严重疾病，我国乙肝病毒携带者1亿1千万人，其中40％左右的慢性肝炎可能发展成为肝硬化和原发肝癌。以往乙肝疫苗是从人血清中提取，基因工程乙肝疫苗的研制成功，不仅有巨大的经济效益，而且有巨大的社会效益。基因工程乙肝疫苗是我国正式批准投放市场的第一种高技术疫苗，在20多项指标上达到国际先进水平，获国家科技进步一等奖。继乙肝疫苗之后，我国又研制成功了痢疾、霍乱等数种基因工程疫苗，并经国家批准进入临床试验。

第62页/共100页基因工程药物干扰素是一种广谱的抗病毒和抗肿瘤高技术药物，对防治病毒性肝炎和恶性肿瘤有重要的作用。现已有了3个品种的基因工程干扰素获得国家新药证书，开始大批量生产。除此之外，我国还研制成功了肝癌导向药物（生物炸弹）、系列恶性肿瘤辅助治疗药物等十余种基因工程药物，有些已获试生产文号或进入中试开发阶段。动物克隆和转基因研究

2003年10月16日，“神舟”五号成功着陆的同一天，包括两头转基因体细胞克隆牛在内的10头体细胞克隆牛现身山东梁山县。我国转基因体细胞克隆技术及体细胞克隆技术的研究与应用达到国际前沿水平。

3月25日出生的体细胞克隆牛“乐娃”，由于成功地转入了绿色荧光蛋白基因，成为我国首例转基因体细胞克隆牛，标志着我国在转基因体细胞克隆技术方面的新突破。第63页/共100页第64页/共100页制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。1.对环境的影响2.新型病毒的出现重新组合一种在自然见尚未发现的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。一、基因工程的安全隐患1.3基因工程的安全性第65页/共100页将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。4.人造生物扩散新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。3.癌症扩散第66页/共100页1.公众的担忧二、重组DNA研究的安全准则1973年美国的公众第一次公开表示担心应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。第67页/共100页1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请PaulBerg博士组成一个重组DNA咨询委员会。这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。2.专家的态度第68页/共100页3.制定安全规则1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。第69页/共100页分4级：P1—P4级。（1）实验室的物理安全4.基因工程的安全措施一般装备良好的普通微生物实验室。①P1级实验室②P2级实验室在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。第70页/共100页全负压的实验室，同时装备安全操作柜。④P4级实验室专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。具有最高安全防护措施。③P3级实验室第71页/共100页在自然环境中无法存活。（2）实验室的生物安全分3级（大肠杆菌）：EK1—EK3级。①EK1级的大肠杆菌在自然环境中一般都要死亡。②EK2-EK3级大肠杆菌第一个“安全”菌株是K12（1976年），很不实用，已淘汰。第72页/共100页（3）

载体的安全应该是失去了自我迁移的能力。不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。（容易构建）。如pMB9，pBR322等。第73页/共100页一、基因工程在农业生产中的应用1.提高植物的光合作用效率1.4基因工程的应用改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。（1）提高CO2的固定率改变光能交换系统的分子的基因结构。（2）提高光能吸收率和转化率第74页/共100页使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。2.提高豆科植物的固氮效率是农业生物技术的主要内容。是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。3.转基因植物第75页/共100页世界各国转基因作物大田释放情况（1987.1-1998.4）转基因作物特性批准项数所占比例抗除草剂129729.6%抗虫104623.8%产品质量高88620.2%抗病毒4369.9%农学性状好2114.8%抗真菌2084.7%其它3036.9%第76页/共100页中国已经批准进入大田的转基因植物（1998.3）转基因植物特性申请单位获批准数马铃薯抗病毒中科院4抗病中国农科院1抗逆北京大学1高营养品质北京大学1水稻抗虫中科院1抗病毒北京大学2抗病农科院2抗除草剂水稻所1第77页/共100页棉花抗虫中科院农科院美国孟山都公司9玉米抗虫美国孟山都公司等3大豆抗除草剂农科院1小麦抗除草剂北京农林科学院1高营养品质北京农林科学院1番茄抗病北京大学1耐储存中科院华中农大3甜椒抗病北京大学1第78页/共100页辣椒抗病毒中科院1烟草抗病毒北京大学2抗虫中科院北京大学2番木瓜抗病毒中国热带作物1广藿香抗病农业科学学院1矮牵牛改变花色北京大学1杨树抗虫中科院1微生物提高固氮效率中科院农科院华中农大广东微生物所6第79页/共100页第80页/共100页将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。4.转基因动物在乳汁中分泌人组织纤溶酶源激活物（TPA）和尿激酶的转基因小鼠；分泌a1抗胰蛋白酶的转基因山羊等。第81页/共100页转移大鼠生长素基因的小鼠第82页/共100页未来可能出现的人造动物？第83页/共100页二、基因工程在工业中的应用克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。1.纤维素的开发利用2.酿酒工业第84页/共100页三、基因工程在医药上的应用1976年，27岁的风险投资人RobertSwanson与UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！第85页/共100页Genentech的骄人业绩1976Genentech创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素基因1980公司上市，募集$35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）1984第一个VIII因子，转让给CutterBiological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（TPA）1990生产interferon1

1990与瑞士Roche医药公司合并（$2.1billion）第86页/共100页制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS）2.用微生物生产药物3.技术设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗1.用转基因植物或动物生产药物大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂第87页/共100页美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中文名称商品名称英文名缩写开发公司胰岛素HumulinNovolinHumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生长激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干扰素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFN

rhuIFN1brhuIFN1brhuIFNa3ScheringRocheBiogenChironGenentechInterferonScience第88页/共100页白细胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒细胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒细胞巨噬细胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex红细胞生成素EpogenProcritrhuEPOAmgenOrtho组织溶纤原激活剂ActivaserhuTPAGenentech生长激素SerostinsomatotropinSerono促生长素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSeronoPharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneral第89页/共100页抗血友病因子VIIIKogenateRecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄脑苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脱氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline第90页/共100页体内用单克隆抗体ReoproOrthoOKT-3OncoScintCR/OVOncoScintOC103OncoScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocorOrthoBiotechCytogenCytogenCytogenCytogen鼠单克隆抗体Panorex