DNA体外合成与序列测定

DNA体外合成与序列测定第1页/共51页DNA的化学合成合成的原理核酸固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMTr保护，3′-OH上的磷酸基上有-N(C3H7)2和-OCH3两个基团。2023/3/112第2页/共51页2023/3/11南京农业大学生命科学学院3每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(1)脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5′-OH。(2)缩合：新生成的5′-OH在四唑催化下与下一个核苷3′-磷酰亚胺单体缩合使链增长。(3)盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4)氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸。第3页/共51页DNA的化学合成2.合成后处理合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，要经过以下合成后处理才能最后应用。切割：合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3′-OH。脱保护：切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基β-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55℃放置15h左右方能脱掉。纯化：纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质。通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。纯化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化。近年来发展了一些修饰试剂，可在合成寡核苷酸时，对某些核苷酸进行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。2023/3/114第4页/共51页第二节DNA的体外合成聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快速扩增特异DNA序列的技术。此技术于1985年由Mullis发明，1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令该技术使用更加方便、有效。PCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大发明之一，这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙，而且还表现在它的出现高速发展了大量在以前看来似乎不可能的生物学技术。Mullis因其卓越的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖。2023/3/115南京农业大学生命科学学院第5页/共51页聚合酶链式反应（PCR）PCR的原理：原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合成靶DNA。PCR包括三个基本过程：变性。加热模板使其解离成单链。退火。降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。延伸。在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3′端向前延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链。这样变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板，经过30～35个循环后，界于两个引物之间的靶序列得到大量复制，拷贝数约增加106～107倍。2023/3/116第6页/共51页2023/3/11南京农业大学生命科学学院7第7页/共51页核酸序列测定DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前应用最广泛的是：Sanger双脱氧链终止法。Maxam-GilbertDNA化学降解法。新技术：杂交测序法，质谱法，单分子测序法，原子探针显微镜测序法，DNA芯片法。2023/3/11南京农业大学生命科学学院8第8页/共51页Sanger双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。1965，Cornall大学以S．W．Holle，为首的科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。返回DNA核酸序列分析历程第9页/共51页Sanger双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2’，3’双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。第10页/共51页核酸序列测定Sanger双脱氧链终止法基本原理：在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。2023/3/11南京农业大学生命科学学院11第11页/共51页反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、一种ddNTP、以及四种dNTP（有一种带放射性标记）。变性胶电泳分离反应混合物。放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。考考你：反应混合物中，标记什么最方便？第12页/共51页Sanger双脱氧链终止法基本原理：测序所用的ddNTPddNTPs是反应终止剂，可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs（一般1：3~4）。2023/3/11南京农业大学生命科学学院13在自动测序中将荧光素连在4种ddNTP上第13页/共51页Sanger双脱氧链终止法基本步骤：测序模板的纯化与定量测序反应—PCR仪测序反应产物纯化与变性上样电泳—测序仪分析结果2023/3/11南京农业大学生命科学学院14第14页/共51页2023/3/1115南京农业大学生命科学学院第15页/共51页2023/3/1116南京农业大学生命科学学院毛细管电泳荧光检测第16页/共51页Sanger双脱氧链终止法测序结果：2023/3/11南京农业大学生命科学学院17第17页/共51页DNA测序仪的多种应用：2023/3/11南京农业大学生命科学学院18第18页/共51页Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷分析：这样处理后，能策得高分子量DNA吗？为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。实际上可行吗？高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。第19页/共51页这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。费时费钱，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。第20页/共51页克服缺点的一种途径—DNA分子克隆将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链DNA噬菌体，例如M13作为载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物”。第21页/共51页M13载体克隆DNA片段将DNA片段克隆在M13mp载体特定位点上，即位于Lac区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（polylinker）内。重组体噬菌体，在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。第22页/共51页当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。第23页/共51页荧光标记物ddGTPddATPddTTPddCTP第24页/共51页聚合反应及产物OH3ˊP5ˊ5ˊPHODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP5ˊPddATPddGTP5ˊPddTTP5ˊPddCTP5ˊP第25页/共51页单泳道电泳及信号收集正极负极第26页/共51页核酸序列测定Maxam-GilbertDNA化学降解法基本原理：在一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。鲜明特点是可以探测DNA构象中的蛋白质－DNA相互作用。2023/3/11南京农业大学生命科学学院27第27页/共51页Maxam－Gilbert化学修饰法的原理化学试剂处理末端标记DNA片段，碱基的特异性切割产生的DNA片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。第28页/共51页出发材料：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的末端带有放射性标记的DNA片段(双链或单链）关键：4种核苷酸碱基中，有1～2种发生特异性的化学切割仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要的内容。由于化学切割反应特异性是由碱基的修饰作用决定的，显然，随后的切割反应必定是定量的，而且同副反应无关。第29页/共51页Maxam-GilbertDNA化学降解法基本原理：2023/3/11南京农业大学生命科学学院30第30页/共51页Maxam－Gilbert化学修饰法优点不需要体外酶催合成反应单双链都可以需要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行第31页/共51页Maxam-Gilbert测序法的特异断裂32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATSpecificReactiontoG

化學法無放射線片段不能顯像断裂处断裂处ATCGATCGAT第32页/共51页G反应：DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。G+A反应：甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。T+C反应：肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。C反应：在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。第33页/共51页5ˊPP5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊHOOH5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊ32PP325ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊ32POH3ˊ硫酸二甲酯甲酸肼肼＋NaClGG+AT+CC碱性磷酸单酯酶除去5ˊ磷酸基多核苷酸磷酸激酶γ-32P-ATP分离单链DNA分别在4个试管中进行特异断裂第34页/共51页GG+AT+CC5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG断裂产物分别在4个泳道电泳从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列第35页/共51页化学降解法与双脱氧法的比较Maxam-Gilber化学降解法所能测定DNA序列的长度要比Sanger法短一些，通常说来，化学降解法对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。如今双脱氧核苷酸末端终止法远比Maxam-Gilbert化学降解法应用得更为广泛。但是，化学降解法具有一个Sanger法所不具备的明显优点：即所测核酸序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以对合成的寡核苷酸进行测序，分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，也可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。然而，由于Sanger法的简便快速，仍不失为现今DNA测序的最佳选择方案。2023/3/11南京农业大学生命科学学院36第36页/共51页核酸序列测定基因组测序在大规模DNA测序中，目标DNA分子的长度可达上百万个bp。现在还不能直接测定整个分子的序列，然而，可以得到待测序列的一系列序列片段。序列片段是DNA双螺旋中的一条链的子序列（或子串）。这些序列片段覆盖待测序列，并且序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。在一般情况下，对于一个特定的片段，我们不知道它是属于正向链还是属于反向链，也不知道该片段相对于起点的位置。另外，这样的序列片段中还可能隐含错误的信息。序列片段的长度范围300－1000bp，而目标序列的长度范围是3100万bp，总的片段数目可达上千个。DNA序列片段组装（又称序列拼接）的任务就是根据这些序列片段，重建目标DNA序列。如果能够得到DNA一条链的序列，那么根据互补原则，另一条链的序列也就得到了。2023/3/11南京农业大学生命科学学院37第37页/共51页基因组测序基因组的测序过程一般包括三个步骤：建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC克隆、细菌人工染色体BAC克隆等；利用鸟枪法测定每个克隆的序列；序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，进而对序列的生物学特性进行注释。2023/3/11南京农业大学生命科学学院38鸟枪测序法：大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。第38页/共51页基因组测序鸟枪法测序的缺点随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。引物步移策略将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。2023/3/11南京农业大学生命科学学院39第39页/共51页序列分析的自动化第40页/共51页DNA杂交测序原理第41页/共51页第42页/共51页杂交的检测第43页/共51页杂交测序的应用检测单碱基的变化序列比较分析基因的表达状况验证其他测序第44页/共51页DNA芯片测序

基本原理将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播的寡核苷酸在排