第7章细菌耐药性检测课件

第一节临床常用抗菌药物第二节抗菌药物体外敏感性试验第三节细菌耐药性与产生机制第四节细菌耐药性检测方法第五节厌氧菌和结核分枝杆菌体外抗菌药物敏感试验第六节抗菌药物治疗效果观察第七章 细菌耐药性检测研究细菌耐药性的目的1、指导医生及有关专业人员合理用药2、指导药物学家研究开发新药抗菌药物发现史

上几个重要的里程碑1929年，英国细菌学家Flemin发现微生物的拮抗作用，提示具有临床化疗的可能性。1940年，Chain和Florey接受美国政府的邀请，进行青霉素的研究开发，成功用于临床，开创了化疗新时代。.青霉素溶解其附近的葡萄球菌菌落抗生素时代的开创

——青霉素的发现抗菌药物发现史

上几个重要的里程碑1932年，德国药物学家Domagk发现百浪多息—第一个磺胺类药物，使现代医学进入化疗新时代。1942年，美国科学家Waksman发现链霉素，奠定了从微生物代谢产物中寻找抗生素的基础，造就了抗生素发展的黄金时代。不同抗菌药物的三种作用模式类型抗菌模式作用靶位作用机制Ⅰ抑菌（bacteriostatic）细胞质可逆性抑制：1)

转录2)

转译3)细胞代谢Ⅱ杀菌（bactericidal）染色体不可逆地阻遏基因复制Ⅲ溶菌（bacteriolytic）细胞壁使细胞溶解第一节临床常用抗菌药物一、抗细菌药物二、抗厌氧菌药物第二节体外抗菌药物敏感试验一.药敏试验的抗菌药物选择（NCCLS）二．K-B纸片琼脂扩散法三．稀释法四．E试验五、联合药物敏感试验和杀菌试验第三节细菌耐药性与产生机制一、细菌耐药性定义二、细菌耐药性的产生机制第四节细菌耐药性检测方法一、细菌耐药表型检测二、β-内酰胺酶检测碘淀粉测定法（iodometrictest）头孢色原菌素纸片法（nitrocefintest）三、

耐药基因检测一、厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验

二、结核分枝杆菌药物敏感试验（一）NCCLS关于临床实验室进行结核分枝杆菌体外抗菌药物敏感试验的指征（二） 体外药敏试验抗分枝杆菌药物的选择(三) 结核分枝杆菌体外药敏试验方法比例法，绝对浓度法和耐药率法第五节厌氧菌和结核分枝杆菌体外抗菌药物敏感试验第六节抗菌药物治疗效果观察一、 临床效果（一） 患者临床症状与体征（二） 患者实验室检查二、 细菌学效果（一）病原菌清除的测定（二）细菌耐药性TheendThankyou

（一）β-内酰胺类1.青霉素类2.头孢菌素类3.单环类4.头霉素类5.碳青霉烯类6.β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂

（二）糖肽类

（三）氯霉素

（四）氨基糖苷类

（五）大环内酯类

（六）四环素类（七）氟喹诺酮类（八）磺胺类

（九）利福霉素类（十）林可酰胺类

（十一）恶唑烷酮类（十二）链阳菌素类（十三）抗分枝杆菌药物

返回

二、抗厌氧菌药物硝基咪唑类甲硝唑（Metronidazole）替硝唑（Tinidazole）奥硝唑（ornidazole）返回（一） 耐药筛选试验（二） 折点敏感试验（三） 双纸片协同试验（四） 药敏试验的仪器化和自动化返回返回（一）PCR扩增（二） PCR-RFLP分析（三） PCR-SSCP分析（四） PCR-线性探针分析（五） 生物芯片技术（六） DNA测序返回细菌耐药性的生物化学机制

灭活酶和钝化酶的产生

1.β-内酰胺酶水解药物β-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性。2.氨基糖苷类钝化酶有3类：乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(AAD)，分别通过乙酰化作用、磷酸化作用、核苷化作用灭活此类抗生素。3.氯霉素乙酰转移酶4.红霉素酯酶和其他灭活酶细菌耐药性的生物化学机制

抗菌药物渗透障碍

对革兰阴性菌而言，外膜的通透性对药物进出菌体至关重要。亲水性的药物通道蛋白为OmpF、OmpC和PhoE。抗生素可以直接扩散进入膜内并到达菌体内相应作用部位。疏水性越强的抗生素、带负电荷越多的抗生素分子、较大的药物分子也不易通过。外膜蛋白的缺失可导致细菌耐药性的发生。细菌的外膜上特殊的药物泵出系统使菌体内的药物浓度不足导致耐药。铜绿假单胞菌外膜上有一种蛋白OprK，泵出多种抗生素，是产生耐药的重要机制。细菌耐药性的生物化学机制

生物膜形成

生物膜基质是细菌分泌的多聚物质、吸收的营养物、代谢产物、细胞溶解产物和当时周围环境中的微粒材料和碎石组成的复合体。生物膜基质中的胞外多聚物可与抗菌药物作用，通过阻止药物进入生物膜的屏障作用或吸附抗菌药物有效减少药物浓度，从而保护生物膜内的细菌。另外，生物膜内相互靠近的细菌，通过耐药质粒的转移使细菌产生耐药性。细菌耐药性的生物化学机制

药物作用靶位的改变通过靶位的改变使抗生素不易结合，是耐药发生的重要机制。1.核糖体靶位酶亲和力的改变导致对四环素、红霉素、喹诺酮、氨基糖苷类、甲氧嘧啶、磺胺类抗生素耐药。2.核糖体位点的改变引起对大环内酯类和林可霉素类抗生素耐药。3.DNA螺旋酶的改变是对喹喏酮类抗生素耐药的重要机制。细菌耐药性的生物化学机制

药物作用靶位的改变

4.核酸合成途径中序列靶位酶的改变对磺胺-甲氧嘧啶耐药，二氢叶酸还原酶改变致甲氧嘧啶耐药。5.PBP发生改变,β-内酰胺类抗生素不能结合或亲和力降低，则产生耐药，如金黄色葡萄球菌中PBP转变为PBP2a。大肠埃希菌中PBP3改变，引起对头孢氨苄和其他头孢抗生素耐药。6.肠球菌van基因编码产生肽聚糖上一种前体蛋白，阻碍万古霉素和肽链间相互作用而导致耐药。返回β-内酰胺酶的分类及特征结构分类功能分类名称来源代表酶(Ambler)(Bush)丝氨酸-Lam

C1头孢菌素酶染色体AmpCA2a青霉素酶质粒PC12b广谱酶质粒TEM-1，2、SHV-1

2be超广谱酶（ESBLs）质粒TEM-3∽29,SHV-2∽62br耐酶抑制剂广谱酶(IRTs)质粒TEM30-41,TRC-12c羧苄酶质粒PSE-1、CARB-3

2e头孢菌素酶染色体Cxase

2f非金属碳青霉烯酶染色体IMI-1,NMC-A、Sme-1D2d氯唑西林酶质粒OXA-1,PSE-24青霉素酶染色体Zinc-LamB3金属酶染色体L1返回抗生素敏感性试验概述目的检测细菌的敏感性，指导临床用药？

检测细菌的耐药性，预测临床结果？AST

目的检出细菌对抗生素的耐药性，预测临床治疗结果

预测不是指体外测得的数据，强调对数据的解释

临床不是指体外AST的结果，强调病人用药后的疗效

治疗结果用成功或失败衡量，强调实验室与临床的统一实验室

临床

评价

S成功正确的预测R失败正确的预测S（FS？）失败错误的预测ASTAST体外R≈体内R，对R的结果可以相信体外S≠体内S，对S的结果应持怀疑态度定义：AST是一个检测细菌耐药性的体外抑菌试验（ART）重要性如果没有细菌耐药性检测治疗过度：用药不当，过度使用高档抗生素治疗错误：用药错误，危重患者丧失抢救时机增加不必要的副作用增加不必要的费用增加细菌的耐药性降低医疗服务的质量AST

方法（1）手工试验1.纸片扩散法（S，I，R）2.稀释法（MIC）3.Etest（MIC）（2）自动仪器Vitek，Microscan，Phoenix（3）分子试验PCR直接检测mecA基因（4）酶试验Nitrocefin、ESBL检测AST

结果的解释和报告RISMIC时间依赖性：β-内酰胺类，缩短投药间隔（timeaboveMIC%）=血药浓度高于MIC90的维持时间（h）/给药间隔时间（h）time＞MIC=40~50%good60~70%verygood浓度依赖性：氨基糖苷类，日剂量1次应用时间与浓度依赖抗生素的区分特点与分类代表药物建议投药方法

时间依赖性β-内酰胺类缩短投药间隔，（杀菌作用与血药浓度青霉素类、第1、2、3代尽量延长血药浓度关系不大，无PAE或很短）头孢菌素类和氨曲南超过MIC的时间浓度依赖性氨基糖苷类提高血药浓度，（杀菌作用与血药峰浓度喹诺酮类延长投药间隔时间有关系，有较好PAE）介于二者之间碳青霉烯类，第4代头孢介于二者之间（杀菌作用非浓度依赖，菌素，大环内酯类，有一定PAE）林可霉素，万古霉素AST

结果的解释和报告（续）三要素药物、机体、病原菌相关性体外和体内，抑菌和杀菌，单独和联合预测性耐药表型(个体)→耐药机制→耐药表型(同类)(预测药物)(同类药物)重点监测的耐药菌株：MRS,PRP,VRE,ESBL发出有选择、有解释的报告，与医师直接对话

AST

耐药性统计和分析

WHONET

建立本院、本地区和本国的细菌耐药性监测数据库和网络AST

小结药敏试验

ASTART，用体外试验预测体内结果未经解释、就事论事的报告经过解释、全面的报告表型的检测耐药机制的检测、耐药流行病学分析临床用药

MedicalchoiceBacteriologicalchoice

（一）常规药敏试验（一） 肉汤稀释法用MH肉汤将抗菌药物作不同浓度的稀释后,再接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀灭待测细菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度（MBC）。（二） 琼脂稀释法将不同浓度抗菌药物分别混匀于琼脂培养基中，配制出含各种浓度药物的平板，使用微量多头接种仪接种细菌，孵育后观察细菌在含不同浓度药物的平板上的生长情况，以抑制细菌生长的平板所含的药物浓度测得最低抑菌浓度（MIC）。返回(二)抗菌药物纸片（三） 培养基（四） 细菌接种（五） 结果分析与报告（六） 影响因素（七） 质量控制返回（一） 原理含有定量抗菌药物的纸片贴在测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围可抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。E试验（Epsilometertest）是一种结合了稀释法和扩散法的原理和特点测定细菌对抗菌药物的敏感度的定量技术。原理：E试条是一种宽5mm、长50mm的商品化塑料试条，一面固定有干化、稳定的、浓度呈连续指数增长分布的抗菌药物，另一面有药物的浓度刻度读数（μg/ml）。抗菌药物梯度范围一般为15-20个自然对数。

返回联合药物敏感试验意义联合抑菌试验最低杀菌浓度测定无关拮抗累加协同返回返回返回返回抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。抗菌素抑菌杀菌作用抗菌素抑菌杀菌作用抑制细胞壁合成抑制细菌蛋白质合成破坏细胞膜抑制DNA复制返回青霉素类抗生素——构效关系四个原子的-内酰胺环和五个原子噻唑环有天然青霉素、氨基组、羧基组青霉素、脲基组青霉素引入不用的基团有不同的效应青霉素类抗生素作用机制（1）作用于细胞壁合成后阶段的酶：

转糖基酶转肽酶D-羧肽酶内肽酶青霉素结合蛋白青霉素类抗生素作用机制（2）抑制转肽酶活性转肽酶的转肽反应青霉素结构与D-Ala-D-Ala相似，误认为底物-内酰胺环打开青霉素结合蛋白存在于所有细菌其数量、分子大小及与-内酰胺类抗生素的亲和力随细菌种类不同而不同。定位于胞质膜的表面，均是-内酰胺类抗生素潜在的靶子。青霉素类抗生素杀菌效应细菌裂解细胞壁结构松散，无法承受胞内渗透压而膨胀，和自溶素的激活有关。不裂解的抑制某一种pBp，不诱导自溶素激活。抑菌效应青霉素种类和抗菌活性（1）天然青霉素青霉素G、青霉素V不产青霉素酶的革兰阳性球菌、革兰阴性菌和厌氧性细菌。耐青霉素酶青霉素甲氧西林methacillin苯唑西林oxacillin氯唑西林cloxacillin等异恶唑类青霉素青霉素种类和抗菌活性（2）广谱青霉素氨基组：作用于青霉素G敏感菌，大部分大肠埃希菌，奇异变形杆菌，流感嗜血杆菌。包括氨苄西林(ampcillin)、阿莫西林(amoxicillin)。羧基组：作用于产-内酰胺酶肠杆菌科和假单胞菌，对氨苄西林无效的革兰阴性杆菌，协同氨基糖苷类抗生素对肠球菌抑菌作用,包括羧苄西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)。

青霉素种类和抗菌活性（2）脲基组：对铜绿假单胞菌有抑制作用,包括美咯西林(mezlocillin)、阿洛西林(azlocillin)和哌拉西林(piperacillin)。青霉素+-内酰胺抑制剂：作用于产-内酰胺的革兰阴性和阳性细菌。包括：①氨苄西林-舒巴坦ampicillin-sulbactam(unasyn);②替卡西林-克拉维酸(即替美丁)ticacillin-lavulanate(Timentin);③阿莫西林-克拉维酸(即安美汀)amoxicillin-clavulanate(Augmentin);④哌拉西林-他唑巴坦piperacillin-tazobactam。返回头孢菌素类抗生素——构效关系

天然头孢菌素(cephalosporins)具有7-氨基头孢烷酸结构，即由-内酰胺环和二氢噻嗪环组成头孢菌素中有两个可供修饰的位点,两个修饰位点的联合作用效果使之获得更好的抗菌活性。头孢菌素作用机制头孢菌素与青霉素的作用机制相似,它和青霉素结合蛋白结合抑制细菌细胞壁合成。PBP位于质膜,不同的头孢菌素与不同PBP结合、发生不同效应,使菌体形成丝状体或球形体,最终溶解死亡。头孢菌素种类及抗菌活性第一代对革兰阳性菌有较强的作用,包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、厌氧链球菌,但对耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)、肠球菌、耐青霉素的肺炎链球菌耐药。对革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌中度敏感,对假单胞菌、变形杆菌、沙雷菌和肠杆菌属耐药。作用菌头孢噻啶(cephaloridine，先锋2号)头孢噻吩(cephalothin，先锋1号)头孢氨苄(cephalexin，先锋4号)头孢唑啉(cefazolin，先锋5号)头孢拉啶(cephradine,先锋6号)头孢匹林(cephaprin,先锋8号)头孢羟氨苄(cefadroxil)药名头孢菌素种类及抗菌活性第二代对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌（包括耐氨苄西林菌株）活性强。头孢羟唑(又称多孢孟多，cefamandole)头孢呋辛(cefuroxime,zinacef,西力欣)、头孢尼西(cefonicid)头孢雷特(ceforanide)头孢克洛(Cefaclor,头孢氯氨苄)头孢丙烯(Cefprozil)作用菌药名头孢菌素种类及抗菌活性第三代对革兰阴性肠杆菌科和铜绿假单胞菌具有强大的抗菌活性;对第一、二代头孢菌素耐药的革兰阴性菌敏感;第三代口服头孢菌素对革兰阴性及阳性菌具有更广谱的抗菌活性,但所有口服药对肠球菌、铜绿假单胞菌及不动杆菌无抗菌活性。注射用:头孢噻肟(cefotaxime,claforan,凯复隆)头孢曲松(ceftriaxone,头孢三嗪,菌必治)、头孢唑肟(ceftizoxime,epocelin)头孢他啶(ceftazidime,fortum,复达欣)头孢哌酮(cefoperazone,Cefobid,先锋必)口服用:头孢克肟(cefixime)头孢布坦(ceftibuten)头孢迪尼(cefdinir)头孢泊肟(cefpodoxime)

作用菌药名头孢菌素种类及抗菌活性第四代该品和1型-内酰胺酶亲和力低,稳定性强头孢匹罗(cefpirome)头孢匹美(cefepime)（又称头孢吡肟）和cefclidin作用菌药名返回

一、单环β-内酰胺类抗生素

由单个-内酰胺环和该环连接的不同侧链构成,母核为3-氨基单菌霉酸。本类抗生素对染色体或质粒介导的-内酰胺酶相当稳定,对革兰阴性菌外膜有良好的穿透作用,并和阴性需氧菌的PBP3结合,抑制细胞分裂,促使细菌死亡。对革兰阴性菌作用强,对革兰阳性菌和厌氧菌几乎无作用,包括氨曲南(aztreonam,菌克单)等。其它β-内酰胺类抗生素返回其它β-内酰胺类抗生素

1.头霉素(cephamycins)抗生素化学结构、抗菌谱与抗菌活性与头孢菌素相似，常将该类抗生素置于第2代头孢菌素中论述,包括头孢西丁(cefoxitin)、头孢替坦(cefotetan)、头孢美唑(cefmetazole)。它们对革兰阴性菌产生的-内酰胺稳定,对革兰阳性菌有较好的抗菌活性,特点为对包括脆弱类杆菌厌氧菌有高度抗菌活性。二、头霉素类和氧头孢烯类其它β-内酰胺类抗生素

2.氧头孢烯类(moxalactam)具有第三代头孢菌素的特点,抗菌谱广,杀菌作用强,对-内酰胺酶高度稳定,对临床分离的产酶耐药阴性菌有很强的抗菌作用。

二、头霉素类和氧头孢烯类返回其它β-内酰胺类抗生素青霉素类噻唑环的硫原子被碳原子取代对其它所有的由质粒或染色体介导的-内酰胺酶稳定,因而是目前所使用抗生素中有最广抗菌谱的药物。但对耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）仍显示耐药。该类抗生素有亚胺培南(impenem)、米洛培南(meropenem)、必安培南(biapenem)、帕尼培南(panipenem)。三、碳青霉烯类返回-内酰胺酶抑制剂

-内酰胺抑制剂与-内酰胺酶有较高的亲和性以竞争性和不可逆的抑制方式发挥作用，与-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性。克拉维酸舒巴坦他唑巴坦返回氨基糖苷类抗生素

由链霉菌属和小单胞菌属发酵滤液中提取。含2个或多个氨基糖分子，1个六元环氨基环醇,以糖苷键结合。种类及构效关系氨基糖苷类抗生素细菌核糖体30S小亚基发生不可逆的结合

作用机制抑制mRNA的转录和蛋白合成

造成遗传密码子的错读,产生无意义的蛋白质

•依靠其离子的吸附作用，吸附在菌体表面，造成细胞膜的损伤，为杀菌类抗生素。•通过主动的运输进入胞质内，当和细胞壁合成抑制物联合使用时产生协同作用。氨基糖苷类抗生素种类和抗菌活性半合成氨基糖苷类：阿米卡星(amikacin)、奈替米星(netilmicin)、地贝卡星(dibecacin)由小单胞菌属发酵滤液中提取：庆大霉素(gentamycin);、福提霉素(fortimicin)对需氧革兰阴性杆菌有强大的抗菌活性。阿米卡星对钝化酶的稳定性强于庆大霉素和妥布霉素，但对多种革兰阴性菌抗菌活性不及前者，临床上可应用于3~4倍剂量弥补其不足。奈替米星对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌活性为其他氨基糖苷类抗生素所不及。大观霉素（spectinomycin）和丙大观霉素（trospectomycinsulphate）也为氨基糖苷类抗生素，前者对淋病奈瑟菌敏感，对产酶的耐青霉素淋病奈瑟菌（PPNG）也敏感，对解脲脲原体作用良好。链霉菌属发酵滤液体提取：链霉素(streptomycin)、卡那霉素(kanamycin)、妥布霉素(tobramycin)、核糖霉素(ribsomycin)、巴龙霉素(paromycin)、新霉素(neomyci）抗菌活性种类（按来源分）返回喹诺酮类抗生素

喹诺酮类(quinolones)是一组具有潜在抗菌活性的抗生素。在萘啶酸基本母环上6位被氟取代,多数7位上有一个哌嗪环。作用于DNA旋转酶。该旋转酶(II型拓扑异构酶)在原核细胞DNA复制过程中引入负超螺旋结构,使复制移动时不因张力太大而不能前进。由于药物拮抗了该酶，干扰了细菌DNA复制、修复和重组。构效关系和作用机制喹诺酮类抗生素

种类和抗菌活性

为超广谱类抗生素,对革兰阳性菌、MRS、PRSP和肠球菌优于第二代，对厌氧菌均有作用。第三代喹诺酮类司帕沙星(sparfloxacin)、妥舒沙星(tosufloxacin)、左氟沙星（levofloxacin）对革兰阴性和阳性细菌均有作用第二代喹诺酮类环丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin,氟嗪酸)、洛美沙星(lomefloxacin)、氟咯沙星(fleroxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin,氟哌酸)。抗菌活性菌名返回大环内酯类抗生素

构效关系

分子结构中具有14~16个原子的大脂肪族内酯环,内酯环的不同位点有甲基和羟基取代物,通常在5位上连接有一个糖苷替代基,有的在3位上连有第二个糖苷基。作用机制大环内酯类抗生素可逆结合在细菌核糖体50S大亚基的23S单位上,抑制肽酰基转移酶，影响核蛋白位移,抑制细菌蛋白合成和肽链的延伸。

大环内酯类抗生素种类及抗菌活性

抗菌谱和青霉素相仿新一代大环内酯类药物具有调节免疫功能、增强单核-吞噬细胞吞噬的功能。常用的有红霉素(etythromycin)、柱晶白霉素(kitasamycin)、麦迪霉素(medemycin)、乙酰螺旋霉素(acetylspiramycin)。新一代大环内酯类有克拉霉素(clarithromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、氟红霉素(flurithromycin)、阿齐霉素(azithrymocin)、罗地霉素(rokitamycin)和米欧卡霉素(miocamycin)抗菌作用种类返回

四环素类抗生素

本类抗生素均具有四个线性紧连的萘环母核。6位、7位修饰后的半合成四环素,具有高血液浓度,对某些耐受四环素的菌株有较高的活性。构效关系作用机制细菌的30S核糖体亚单位结合,阻滞酰基转移RNA与信使RNA核蛋白体的受位位点的结合,阻滞肽链延伸,抑制蛋白质合成。四环素类抗生素种类及抗菌活性

为广谱抗生素,抗菌活性的顺序为：米诺环素(min