不同碳源的生物除磷效率及合成HAs结构

不同碳源的生物除磷效率及合成PHAs结构分析摘要由由于PHB的加工性能能欠佳，目前前对PHAs的合成研究究多集中在中中短链PHAs共聚共混物物上。针对食食品、发酵厂厂废水含多种种可发酵基质质的特征，分分别采用乙酸酸钠、乙醇、葡葡萄糖、可溶溶性淀粉和谷谷氨酸钠为唯唯一碳源，研研究了SBR反应器中生生物除磷的能能力及合成PHAs的特性。这5种碳源在厌厌氧阶段的磷磷释放量分别别为10.12、1.63、7.88、2.44和5.00mg/L，在好氧阶阶段的吸磷量量分别为0.64、6.37、8.10、1.21和3.05mg/L，总吸磷效效率的次序为为乙醇（乙酸酸）>葡萄糖>可溶性淀粉>谷氨酸钠。反反应液碱性不不断增加导致致乙酸钠吸磷磷能力受破坏坏，4h好氧吸磷量量仅为0.64mg/L，较多的小小分子有机酸酸生成有利于于好氧吸磷能能力的提高。用GC-MS解析了这5种碳源合成PHAs的结构，分别由乙酸钠、乙醇和谷氨酸钠为唯一碳源所合成的PHAs主要为PHB，以葡萄糖和可溶性淀粉所合成PHAs主要为PHBV，分析了不同碳源合成PHAs的代谢途径，PHAs产物中琥珀酸的检出证实了三羧酸循环参与了合成代谢。在谷氨酸钠和可溶性淀粉合成产物中，混有菌体内长链烷酸和烯酸如硬脂酸、软脂酸和油酸。关键词：碳源，除除磷，PHAs，结构1前言PHAs（pooly-hyydroxyyalkannotes，聚羟基脂脂肪酸酯）是是活性污泥中中重要的碳源源储存物质，由由许多原核微微生物在不平平衡生长条件件下合成，担担当生物除磷磷过程的能量量转化作用。它它是一种性能能良好的高分分子聚合物，具具有完全可生生物降解性，是是替代化学合合成塑料消除除“白色污染”的理想新型型塑料，也是是医疗植入用用的理想可降降解性高分子子材料。该领领域的研究涉涉及环境科学学、生物化学学、分子生物物学和高分子子化学多个学学科。能产生PHAss的微生物种种属有产碱杆杆菌属、假单单胞菌属、甲甲基营养菌、固固氮菌属、红红螺菌属和重重组大肠杆菌菌等[1]。在真真养产碱杆菌菌及多数微生生物中，合成成PHB（poly--3-hyddroxybbutyraate，聚3-羟基丁酸酯酯）的碳源有有糖类、有机机酸、乙醇和和二氧化碳等等多种含碳化化合物。PHB是PHAs中最常见且且被研究最多多的一种，但但它的结构单单一规整，结结晶度高（65－80％），质脆脆，抗冲击强强度低，熔点点高（171－182℃），熔融状状态下易降解解为烯酸，加加工温度区间间窄，混合菌菌种或混合碳碳源生成的PHAs共聚共混物物将会明显改改善其加工性性能。食品、发发酵厂废水含含有大量可发发酵碳源，本本研究以此类类废水的代表表性成分如葡葡萄糖、乙酸酸钠、乙醇、可可溶性淀粉及及谷氨酸钠为为唯一碳源，探探讨在厌氧/好氧释磷吸吸磷过程的效效率，通过所所合成PHAs结构分析，阐阐明不同碳源源合成PHAs的代谢途径径，为中长链链PHAs的生物合成成提供理论依依据。2实验装置、材材料及方法2.1实验装置置自制SBR有机机玻璃反应器器，圆柱状部部分直径14.5ccm，高20cm，锥底部分分高10cm，总有效体体积3.5L。砂芯曝气气头从反应器器下部供气，由由中控器完成成厌氧/好氧、进水/排水/排泥的状态态切换，装置置图如图1所示。1－反应器主体体2－进水阀3－出水阀4－排泥阀5－空气阀6－氮气阀7－DO仪8－pH计9－水位计10－中控器图1反应装装置示意图2.2实验材料料活性污泥：广州州市猎德污水水处理厂；废废水：生活污污水、人工配配制废水；化化学试剂：均均为市售分析析纯。3-羟基丁酸酯PHB标准样品：：购自ICI公司。人工工配制废水主主要成分见表表1，5种主要碳源源分别按照800mgg/L的浓度加入入，其组成及及含量见表2。表1人工配配制废水成分分（不含碳源源）成分乙酸铵KH2PO4MgSO4·77H2OFeSO4·77H2O浓度（mg/LL）5515.35105表25种碳碳源的含量成分葡萄糖乙酸钠乙醇可溶性淀粉谷氨酸钠浓度（mg/LL）7501040384687823污泥驯化方法：：加水，通氮氮气5min，厌氧2h；开始曝气气，好氧4h，静置30min后排去上清清液，补加生生活污水，循循环多个周期期，定期排泥泥。2.3分析方法法总磷（TP）：：硝酸-高氯酸法消消解，钼锑抗抗分光光度法法；CODCr：重铬酸酸钾法；SS：重量法。[[2]PHAs色谱分分析样品制备备：取适量污污泥冻干，将将定量污泥装装入螺纹封口口管中，加入入2ml含3％（v:v）浓硫酸的的甲醇及2g/L苯甲酸（作作为内标），加加入2ml氯仿后，盖盖紧盖子，100℃水浴，酯化4h冷却。加入2ml超纯水，充充分混匀，离离心或室温沉沉降30min以上，分层层，取下层有有机相作色谱谱分析[3]]。仪器条件：岛津津GCMS--QP20110气质联用，色色谱柱型号DB-1，30m×00.25mmm×0.255μm。升温程序：1000℃保持2min后以10℃/min的速度升温温至200℃，接着以20℃/min升温至250℃，保持1min。进样温度度：260℃，GC-MS接口温度为260℃，MS质量扫描范范围：20－550。3结果与讨论3.1污泥的的驯化经过2个月的驯驯化，污泥颜颜色由棕黑色色渐变为棕黄黄色，MLSS保持在3000－6000mmg/L之间。污泥泥的沉降性能能有了显著改改善，SVI＝47.5mml/g，好氧曝气气、静置后的的上清液SS<100mg/L。3.2不同碳碳源的释磷吸吸磷能力模拟食品、发酵酵厂的废水，选选择具代表性性的乙酸钠、乙乙醇、葡萄糖糖、可溶性淀淀粉和谷氨酸酸钠（味精）为为碳源，按照照初始COD约为800mgg/L配水，其余余成分同表1，将污泥平平分为5份分别接入入，经过2h厌氧及4h好氧后的TP浓度变化见见图2。图2不同碳碳源在厌氧/好氧条件下下的TP浓度变化曲曲线将5种碳源在22h厌氧及4h好氧过程的TP浓度变化数数值列于表2中。对图2及表2数据进行分分析，在厌氧氧阶段，释磷磷量由大到小小为乙酸钠>葡萄糖>谷氨酸钠>可溶性淀粉>乙醇；在好好氧阶段，吸吸磷量由大到到小为葡萄糖糖>乙醇>谷氨酸钠>可溶性淀粉>乙酸钠。葡葡萄糖在厌氧氧过程释放磷磷量为7.88mmg/L，稍低于乙乙酸钠的10.122mg/L，但其好氧氧吸磷量却是是最大为8.10mmg/L。从全过程程的绝对吸磷磷量计算，当当乙醇作为碳碳源时，厌氧氧阶段释磷最最少，有效吸吸磷量为6.00mmg/L。至于乙酸钠在好好氧阶段较少少吸磷的原因因，我们认为为在配制人工工废水时，采采用了乙酸的的钠盐来维持持反应液的pH，当乙酸根根作为碳源参参与了微生物物的代谢后，Na＋由此游离出出来，反应液液的pH值不断升高高至9－10，而微生物物吸磷的最佳佳pH值在5.5－6.5之间，过高高的pH值使吸磷能能力大大降低低。当乙醇为为碳源时，在在厌氧条件下下很难被微生生物代谢，因因此厌氧释磷磷最少，但在在好氧条件下下生成乙酸并并随时被利用用，反应液的的pH比较稳定。因因此，以乙醇醇为碳源实际际上是乙酸在在反应中起作作用。可溶性性淀粉为葡萄萄糖长链，其其分子大小在在240－3800葡萄糖单位位范围，必须须水解为葡萄萄糖后才能被被微生物吸收收利用。谷氨氨酸钠带有一一个-NH2，也要先经经过脱氨基才才能进一步参参加代谢，因因此这两种物物质的代谢速速率比较慢。从从吸磷量大小小顺序分析也也可得出较小小的分子有利利于吸磷且厌厌氧释磷多好好氧吸磷也多多的结论。在在实际除磷工工艺中，要根根据不同来源源废水的碳源源性质，控制制厌氧/好氧反应条条件以生成尽尽量多的小分分子有机物，力力求达到较高高的除磷效率率。表2不同碳碳源在厌氧/好氧条件下下的TP浓度变化单位：mg/L碳源种类乙酸钠乙醇葡萄糖可溶性淀粉谷氨酸钠初始TP5.776.776.406.456.77厌氧释磷量ΔPP110.121.637.882.445.00好氧吸磷量ΔPP20.646.378.101.213.05*注：ΔP11＝第2h的瞬时总磷磷浓度－初始始总磷浓度ΔP2＝第2hh的瞬时总磷磷浓度－第6h的瞬时总磷磷浓度3.3不同碳碳源所合成PHAs的结构及代代谢途径分析析为实现污（废）水水处理的资源源化目标，将将好氧后的富富磷污泥排出出，进行5种不同碳源源合成PHAs的实验，并并对产物进行行GC-MS分析，以确确定其结构。污污泥的培养采采用好氧6h，厌氧12h进行，PHB标准样品及5种碳源所合合成PHAs的GC-MS图见图3。图3-aPPHBV标准品的GC-MS图图3-b以以乙酸钠为碳碳源所合成PHAs的GC-MS图图3-c以以乙醇为碳源源所合成PHAs的GC-MS图图3-d以以葡萄糖为碳碳源所合成PHAs的GC-MS图图3-e以以可溶性淀粉粉为碳源所合合成PHAs的GC-MS图图3-f以以谷氨酸钠为为碳源所合成成PHAs的GC-MS图经质谱解析不同同保留时间所所对应的物质质列于表3，可以看出出，由乙酸钠钠、乙醇为碳碳源所合成PHAs组分比较单单纯，经过6h好氧过程，乙乙醇经氧化转转变为乙酸，然然后它们通过过同样的代谢谢途径合成为为PHB：乙醇乙乙酸乙酰CoA乙酰乙酰CoA3--羟基丁酰CoAPHHB多糖作为微生物物营养时，必必须在微生物物细胞外被相相应的酶水解解为单糖或双双糖，才能被被吸收和利用用。某些能利利用淀粉的微微生物可以向向胞外分泌淀淀粉酶，使淀淀粉水解成葡葡萄糖后才被被吸收入细胞胞内进一步降降解。因此，在在以可溶性淀淀粉为基质的的PHAs合成过程中中，主要产物物与葡萄糖的的相同。乙酰CoA乙酰乙酰CoAD(--)3-羟基丁酰CoA淀粉葡萄萄糖丙酮酸PHBVV丙酰CoA丙酰乙酰CoAD(--)3-羟基戊酰CoA味精的主要成分分是谷氨酸钠钠，谷氨酸是是一种有代表表性的氨基酸酸，在动、植植物、微生物物中普遍存在在的是L-谷氨酸脱氢氢酶，催化L-谷氨酸脱氢氢脱氨基，生生成α-酮戊二酸，这这些分解产物物可进一步参参加代谢，进进入三羧酸循循环、转变成成糖和脂肪或或合成新的氨氨基酸。Dioniisi[4]]等在以谷氨氨酸为唯一碳碳源合成PHAs的研究中，未未发现PHAs或糖原积累累现象，而本本研究从GC-MS图谱中，可可以发现由谷谷氨酸钠合成成了PHAs且为PHB，代谢途径径如下：琥珀酸谷氨酸α-酮戊二酸琥珀酰CoA乙酰乙酰CoAPHHB在所有合成PHHAs的产物中都都检测出了HHOOC-CCH2-CH2-COOHH（琥珀酸），也也间接证明了了三羧酸循环环对PHAs合成的参与与。值得注意意的是在以可可溶性淀粉和和谷氨酸钠为为碳源合成的的PHAs产物中检测测出了3-羟基癸酸（3-hyddroxyddecanooate，HD）和3-羟基十二酸酸（3-hyddroxyddodecaanoatee，HDD），可能是是外加碳源与与菌体内原有有脂肪酸共同同参与了PHAs的合成。同同时其中还混混有一些长链链脂肪酸（烷烷酸和烯酸），表表明菌体内原原有的脂肪酸酸在用氯仿提提取时也被提提取出来。在在微生物菌体体内脂肪酸的的碳原子大都都为偶数，含含量最多且普普遍存在的高高级脂肪酸有有硬脂酸、软软脂酸和油酸酸[5]，本研研究结果与之之相当吻合，它它们对PHAs的性能影响响还需进一步步研究，如以以PHAs为产品的生生产也需考虑虑提取分离技技术对纯度的的影响。表3图3aa－f中各峰所对对应物质图名峰名结构式物质名称图3-a1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHB单体）2C6H5COOOH苯甲酸（内标物物）图3-b1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHB单体）2HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸3C6H5COOOH苯甲酸（内标物物）图3-c1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHB单体）2HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸3C6H5COOOH苯甲酸（内标物物）图3-d1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHB单体）2CH3-CH22-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基戊酸（PHV单体）3HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸4C6H5COOOH苯甲酸（内标物物）图3-e1CH3-CH（OH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHB单体）2CH3-CH22-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基戊酸（PHV单体）3HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸4C6H5COOOH苯甲酸（内标物物）5CH3-（CHH2）6-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基癸酸6CH3-（CHH2）14COOHH十六碳酸（软脂脂酸）7CH3-（CHH2）8-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基十二酸酸8CH3-（CHH2）7-CH＝CH-（CH2）7COOH十八烯酸（油酸酸）9CH3-（CHH2）16COOHH十八碳酸（硬脂脂酸）图3-f1CH3-CH22（OH）-CH2COOH3-羟基丁酸（PHB单体）2HOOC-CHH2-CH2-COOHH琥珀酸3C6H5COOOH苯甲酸（内标物物）4CH3-（CHH2）6-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基癸酸5CH3-（CHH2）14COOHH十六碳酸（软脂脂酸）6CH3-（CHH2）8-（CH）（OH）-CH2COOH3-羟基十二酸酸7CH3-（CHH2）7-CH＝CH-（CH2）7COOH十八碳烯酸（油油酸）8CH3-（CHH2）16COOHH十八碳酸（硬脂脂酸）综合以上分析，活活性污泥作为为混合菌群，其其中存在大量量微生物。在在好氧阶段一一方面可以实实现微生物的的增殖，另一一方面，可以以氧化生成大大量能量物质质（CoA），作为PHAs合成的前体体。在厌氧阶阶段，一部分分厌氧微生物物通过丁酸型型发酵途径生生成β-羟酰CoA，然后PHAs聚合酶将各各个β-羟酰CoA通过酯键连连接成聚酯。由由于活性污泥泥是多菌群体体，不同的微微生物的代谢谢途径不尽相相同，本研究究还将对其中中的主要储磷磷、合成PHAs菌种进行纯纯化培养，以以明确各个菌菌种在单一及及混合碳源下下累积PHAs的特性。4结论4.1在以乙乙酸钠、乙醇醇、葡萄糖、可可溶性淀粉和和谷氨酸钠为为碳源厌氧/好氧释磷吸吸磷的研究中中发现，吸磷磷效率是乙醇醇（乙酸）>葡萄糖>可溶性淀粉>谷氨酸钠。可可溶性淀粉需需先水解为葡葡萄糖、谷氨氨酸钠需先脱脱氨基才能进进一步代谢，在在厌氧阶段生生成较多的小小分子有机酸酸如乙酸等有有利于好氧阶阶段的吸磷。4.2分别以以乙酸钠、乙乙醇、谷氨酸酸钠为唯一碳碳源合成PHAs为PHB，以葡萄糖糖、可溶性淀淀粉为唯一碳碳源合成PHAs为PHBV。4.3在PHHAs产物中检测测出了琥珀酸酸，证实三羧羧酸循环参与与了PHAs的合成代谢谢。4.4在以可可溶性淀粉和和谷氨酸钠为为碳源的合成成产物中均提提取到了硬脂脂酸、软脂酸酸和油酸，说说明用氯仿提提取的脂肪酸酸是PHAs与菌体内的的其它高级脂脂肪酸的混合合物。参考文献[1]YuppLee,,Sangg.Baccteriaalpollyhydrroxyallkanoaates.Bioteech.&&Bioeeng.11996,49(1)):1-144[2]国家环环保局《水和和废水监测分分析方法》编编委会。水和和废水监测分分析方法（第第三版）[M]。北京：中中国环境科学学出版社，1989[3]RiiisV.,,MaiW.Gaaschrromatoographhicdeetermiinatioonofpoly--β-hydrroxybuutyriccaciddinmmicrobbialbbiomasssaftterhyydrochhloriccaciddproppanolyysis.JournnaloffChroomatoggraphyy.19888,4455:285--289[4]D.Dioniisi,CC.Levvantessi,V..Renzzietal.PPHAsttorageefrommseveeralssubstrratesbydiiffereentmoorphollogicaaltyppesinnanaanoxicc/aeroobicSSBR.WWaterSci.&Tecch.,20002,466(1-2)):337--344[5]大连轻轻工业学院主主编。生物化化学[M]。北京：轻轻工业出版社社，1981BiologiicalpphosphhorusremovvaleffficieencyaandsttructuuralaanalyssisoffPHAssbyddifferrentccarbonnsourrcesAbstracctThhemacchininngperrformaanceoofmidddle-cchain--lengtth-co--shortt–chainn-lenggthPHHAsissbettterthhanpuurePHHAs.AAnacttivateedsluudgeccultivvatedon5diffeerentsubsttratess(Soddiumaacetatte,etthanoll,gluucose,,soluublesstarchhandsodiuumgluutaminne)asstheonlycarboonsouurcessimulaatedtypiicalffoodaandfeermenttationnfacttoriesstosstudythebbiologgicalphospphorussremoovaleefficiiencyandtthechharactteristticsoofPHAAssynnthesiizediinananaerrobic//aerobbicSBBR.Thhephoosphorrusreeleaseedinaerobbicpeeriodwas110.12、1.63、7.88、2.44and55.00mmg/Lrrespecctivelly,thhephoosphorrusupptakewas00.64、6.37、8.10、1.21和3.05mg/Linannaerobbicpeeriod..Thetotallphossphoruusupttakeeefficiiencywaseethanool(aceetate))>gluccose>ssolubllestaarch>ssodiummgluttaminee.Theegradduallyyalkaalesceencylleadttodetteriorratetthephhosphoorusuu