生物技术制药植物细胞工程

第六章植物细胞工程制药生物技术制药BiotechnologicalPharmaceutics吕艳娜16105基础实验楼31102

生物技术制药基因工程制药动物细胞工程制药抗体制药疫苗植物细胞工程制药酶工程制药发酵工程技术生物技术制药基因工程制药动物细胞工程制药抗体制药疫苗植物细胞工程制药……酶工程制药发酵工程技术

背景直接从植物中提取有效成分可能造成一些珍贵植物的灭绝,人工种植不仅占用大片的耕地，而且面临农药污染、种子退化等问题。为了获得抗癌药物紫杉醇原始的做法是从红豆杉的树皮中提取。红豆杉生长缓慢，提取1kg紫杉醇需要1000颗生长了100年的红豆杉。例如：世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物中国已将其列为一级珍稀濒危保护植物紫杉醇每公斤500～1000万美元。

※植物细胞工程：

以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种、制造新品种、加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术。①上游工程，包括细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏；②下游工程，即将已经转化的细胞应用到生产实践中用以生产生物产品的过程。

植物细胞工程的构成：利用植物组织和细胞培养生产药用成分优点植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因所含色素等杂质较少，所以提取过程相对于从原植物中提取要简单一些。植物培养细胞中有效成分含量高于原植物中的含量。

讨论与总结：培养周期短，有利于节约成本大规模生产。来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较4.与哺乳动物细胞培养系统相比，植物表达系统具有耗费极低而生产蛋白复合物量大的潜力。5.而且植物表达系统不存在来自动物、细菌或者病毒病原体的污染问题。6.1基本概念6.2植物细胞工程发展简史6.3植物细胞的形态及生理特性6.4植物细胞培养的基本技术6.5影响植物次级代谢产物累积的因素6.6植物细胞培养的生物反应器6.7进展与展望目录6.1

基本概念6.2植物细胞工程发展简史6.3植物细胞的形态及生理特性6.4植物细胞培养的基本技术（重点）6.5影响植物次级代谢产物累积的因素（重点）6.6植物细胞培养的生物反应器6.7进展与展望（难点）目录学习目标

掌握：植物细胞培养的基本技术。

掌握：影响植物次级代谢产物累积的因素。

熟悉：常用植物细胞生物反应器的特征及应用。

熟悉：植物细胞制药中常用新技术。

了解：植物细胞工程发展简史。6.1基本概念※（1）Totipotency

任何一个具有完整细胞核的活植物细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。（2）植物的分化：精细胞与卵细胞的结合※易混淆的概念（3）脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化（去分化）。（4）再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根和芽等器官，这个过程叫做再分化。种子完整植株（5）愈伤组织：

在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。植物组织培养过程总结离体的植物器官、组织或细胞（外植体）愈伤组织植物体脱分化dedifferentiation再分化redifferentiation（6）

植物组织或器官的无菌培养定义：指在无菌及人工控制条件下（培养基、光照、温度），研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。主要技术：①植物培养③悬浮培养⑤胚胎培养②愈伤组织培养④器官培养※（7）细胞培养

利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化的培养试验。目的是得到单细胞无性繁殖系。（8）分生组织培养又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。如:茎尖0.1mm（9）Explant

指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织的切段。如：根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药、花粉等。※（10）

无性繁殖系

克隆，使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。（11）Mutant

经过确证已发生遗传变异或新的培养物至少是通过一种诱变处理而发生变异所得的新细胞。（12）

继代培养(subculture)

由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称之为第一代培养。连续许多代的培养即为继代培养，又称连续培养。※※（13）

次级代谢作用和次级代谢产物初级代谢产物：核酸、蛋白质、糖类

次级代谢作用：由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程。次级代谢产物：指生物体生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物体无明显生理功能，或并非是生物体生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。※次级代谢产物的特征：有明显的分类学区域界限生物合成需要在一定的条件下才能发生缺乏明确的生理功能是生命活动的多余成分主要有：生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素、皂苷类、多元酚类思考题一、名词解释

二、问答

1.什么叫植物组织和器官无菌培养？主要包括哪些技术？2.什么叫次级代谢产物？具有哪些特征？P179关键词6.2植物细胞工程发展简史19世纪Schleiden和Schwann提出细胞学说

Schleiden（1804-1881）

Schwann（1810-1882）1.

细胞是有机体，一切动植物都是由细胞发育而来，并由细胞和细胞产物所构成（不可描述成“一切生物都是由细胞和细胞产物构成”）；2.所有细胞在结构和组成上基本相似；3.新细胞是由已存在的细胞分裂而来；4.生物的疾病是因为其细胞机能失常；5.细胞是生物体结构和功能的基本单位；6.

生物体是通过细胞的活动来反映其功能的；7.细胞是一个相对独立的单位，既有它自己的生命，又对与其他细胞共同组成的整体生命起作用。

知识拓展：1902年，德国Haberlandt提出了细胞全能性学说，并进行了植物叶肉细胞、髓细胞、腺细胞、气孔保卫细胞、表皮细胞的培养试验，奠定了细胞工程的基础。20世纪30年代胚胎培养和器官培养50年代期间，组织培养进入新的阶段培养基的设计生物反应器培养动力学等次级代谢产物的调控研究80年代后，高速发展时期20世纪90年代植物细胞培养工程：红豆杉（Taxuschinensis）细胞培养生产紫杉醇——Phyton公司。

分子生物学技术改变植物遗传特性植物细胞培养技术进行有药用价值的天然产物的工业化生产和直接生产次生代谢产物成为主流6.3植物细胞的形态及生理特性6.3.1植物细胞的形态6.3.2植物细胞的结构特征6.3.3植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分

6.3.4植物培养细胞的生理特性P-201

6.3.1植物细胞的形态

植物细胞的形状多种多样，根据植物种类、存在部位和功能而有所不同。

游离的或排列疏松的薄壁细胞：

球形、类圆形和椭圆形排列紧密的细胞：角形具有输导作用的细胞：管状南瓜茎的筛管植物细胞的大小差别很大，大多数高等植物细胞的直径通常约在10-100μm之间，一般必须在显微镜下才能看到。也有少数植物的细胞较大，肉眼可以分辨出来，如番茄果肉、西瓜瓤的细胞，直径可达1mm；无节乳管：数米至数十米。细菌的细胞直径小于0.2μm。

CompanyLogo※6.3.2植物细胞的结构特征

高等植物细胞都是真核细胞，具有典型的、为双层膜包被的细胞核。生理活性物质模式植物细胞细胞壁原生质体后含物：贮藏/废弃/次级代谢产物细胞膜细胞质细胞器细胞核胞间层初生壁次生壁质体线粒体液泡内质网核糖体高尔基体动物细胞植物细胞细胞膜细胞核线粒体内质网高尔基体核糖体中心体细胞壁质体液泡

※植物细胞与动物细胞比较6.3.3植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分

生理活性物质，生命物质（酶、维生素、激素和抗生素等）含量少，对细胞内生化代谢和生理活动起重要的调节作用；

后含物，非生命物质（生物碱、苷类、有机酸、挥发油、糖类、盐类等）多为贮藏物质和废弃物质，多存在于液泡内。※

①酶类（enzyme）：有机催化剂，生物体内所有的反应都是在酶的催化作用下进行的。（1）

生理活性物质

①酶具有高效率的催化能力。②酶具有专一性。③参与反应后，本身的性质和数量不改变。④酶的作用条件较温和。酶的特性

②维生素（vitamin）：生物的生长和代谢所必需的微量有机物，生命体内主要作为酶的辅酶或辅基，也做为合成其他物质的原料。维生素A维生素脂溶性维生素水溶性维生素维生素D维生素E维生素K维生素B族维生素C

③植物激素（phytohormones）：植物细胞原生质体产生的一类复杂的调节代谢的有机物质，影响生理过程，量微，作用大。

已知有七类：

脱落酸、植物生长素、细胞分裂素、乙烯、赤霉素、寡糖素（防御反应）和油菜固醇内酯（油菜素甾醇，诱导生长和分化）。

④抗生素和植物杀菌素（antibiotic）：

抗生素：是由微生物产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质。

青霉素—青霉菌，破坏细菌的细胞壁

植物杀菌素：高等植物如葱、姜、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌物质。链霉素—链霉菌，抗结核杆菌①生物碱（alkaloide）：有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。

麻黄碱—存在于麻黄属植物中，治疗哮喘。

咖啡因—从茶叶、咖啡果中提炼，祛除疲劳、兴奋神经，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。（2）其它成分②糖苷类（glucosides）：某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物。洋地黄毒苷—从毛地黄的叶中提取，属于长效强心苷药物，可治疗充血性心功能不全。紫草宁—从紫草根中提取，亦可细胞培养获得，具有抗癌、抗炎、抗菌等作用。③挥发油（volatileoil）：是一类常温下具有芳香气味并易于挥发的油类，很多可作药用（薄荷油、丁香油、桉油等）。④有机酸（organicacids）：有机酸是糖类代谢的中间产物，是植物果实及细胞液中酸味产生的主要原因。苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。6.3.4植物培养细胞的生理特性细胞大，抗剪切能力差培养过程缓慢，易受微生物污染，需用抗生素中期及对数期，易凝聚为团块，悬浮培养较难培养时需氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌具有群体效应、接触抑制性。细胞产物滞留于细胞内，且产量较低培养过程具有结构与功能全能性。

※讨论与总结（1）主要特征：细胞分裂之后没有进行细胞分离；细胞处于对数生长后期时，开始分泌黏多糖和蛋白质，或者以其他方式形成黏性表面。

悬浮培养的植物细胞很少以单一细胞悬浮状态进行生长，多以非均相集合体的细胞团形式存在。原因①延迟期：细胞数量不变，核酸及蛋白合成较快。②加速期：细胞快速生长期，干重恒定，细胞数、DNA和蛋白质浓度增加，有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力减少。（2）

植物细胞不同生长阶段的特征※③对数期：介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间。增加细胞鲜重、干重及RNA酶活性，蛋白质合成能力完全减退④稳定期：细胞数稳定，细胞高液泡化，非常脆弱，高度分化，有机化合物的高浓度，积累次级代谢产物。表6-46.3小结（植物细胞的形态及生理特性）延迟期、加速期、对数期、稳定期形状、大小结构特征：主要生理活性物质：其他组分：四个生长阶段：细胞壁、液泡、质体酶、维生素、激素、抗生素生物碱、糖苷类、挥发油、有机酸思考题一、填空1.与动物细胞和微生物细胞相比，植物细胞有三个特点：具有——、——和——。2.植物细胞中含有两类代谢产物，一类是——，对细胞内生化反应和生理活动起调节作用；另一类是——，起贮藏物质或废弃物质的作用。二、讨论植物细胞的主要生理活性物质及后含物。植物细胞的生理特征及四个生长阶段。

6.4植物细胞培养的基本技术可分为4个阶段：从普通的生长环境中分离植物组织（外植体）利用无菌技术对所需的植物材料进行无菌处理在严格控制的物理和化学环境中对植物材料进行培养将植物组织还原成可以种植的植株CompanyLogo

植物细胞培养的基本技术包括：6.4.1植物材料的准备6.4.2培养基制备6.4.3培养方法选择

植物组织的选择取决于工作目标，几乎植物的任何部分都能诱导而产生愈伤组织。6.4.1植物材料的准备1.从年轻的植株上取得外植体（避免患病或太老的组织）2.种子也是比较合适的材料之一（种子比柔嫩的植物组织更易于灭菌）植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料,培养前必须对外植体进行严格的灭菌处理。用于植物组织培养的灭菌剂很多，表6-5。

选择表面灭菌剂的原则：灭菌后易于除去或容易分解的试剂。常用的灭菌剂有：次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞次氯酸钙：适用于草本植物和柔软组织，5~30min，

使用浓度9~10%。氯化汞：灭菌效果最好，但去除也最困难，灭菌时间不宜过长。是休眠种子的理想灭菌剂，使用浓度为0.1%，2~10min。※灭菌步骤：①植物材料清洗干净②无水乙醇漂洗③浸入灭菌剂溶液中，5-30min取出④无菌水清洗3遍（除去消毒剂）整个过程在无菌室或是超净台上进行，以保证在消毒灭菌后不再被污染。灭菌时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。表6-66.4.2培养基及其组成植物细胞生长代谢特点：

需大量无机盐、多种维生素和植物生长激素、氮源、以蔗糖为碳源MS、N6、B6、LS、RM-1964、H、T、B5、DBMII、米勒、改良怀特、尼许等。通常都含有无机盐、碳源、氮源、植物生长素、维生素等化学成分。※1.无机盐大量元素---使用浓度大于30mg/L：N,P,S,K,Mg,Ca,Na微量元素---使用浓度小于30mg/L：Fe,Mn,Zn,Cu,B,NiMg：参与物质转运过程、辅酶和激活子的合成K,Ca：抑制某些酶活性，保持某些酶活性或稳定性B：影响膜的功能、通透性Ni:参与脲酶的合成（1）

无机盐异养类型：

常使用糖类、肌醇作为碳源，也可用甘油代替。光自养类型：

直接同化CO2而获取所需要的能量（2）

碳源3.

植物生长调节剂

包括植物激素、某些天然化合物、人工合成的具有生理活性的化合物。

植物激素：是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（<1mol/L）时即能调节植物的生长和发育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。（3）

植物生长调节剂生长素：促进细胞的生长，特别是细胞的伸长。愈伤组织和培养细胞的生长和生存依赖于生长素。低浓度时可以促进生长，高浓度时则会抑制生长。5种天然植物激素：吲哚乙酸(IAA)：第一个被发现和人工合成的的激素二氯本氧乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸(NOA)；NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长分裂素：引起细胞分裂，诱导芽的形成和促进芽的生长。常用的有：6-苄基嘌呤(BAP)6-苄基腺嘌呤(6-BA)激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）玉米素(zeatin、zt)异戊烯氨基嘌呤(2-ip)赤霉素：

刺激叶和芽的生长，加速细胞的伸长。脱落酸：

引起芽休眠、叶子脱落和抑制生长。乙烯：

使植物横向增长，促使果实成熟和花的枯萎。植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和分裂素的比例。高浓度生长素、低浓度分裂素刺激细胞分裂；低浓度生长素、高浓度分裂素刺激细胞生长；大部分植物组织和细胞培养基中都需加入一定量的植物生长调节剂。4.有机氮源使用较多的有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）或各种氨基酸。氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源的供应。苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。（4）

有机氮源

植物细胞通常是自养型的，然而，植物自身合成的量不能满足植物细胞的需要，必须加入B族维生素（B1、B6和泛酸）、一定量的生物素、肌醇。（5）

维生素6.4.3培养方法按培养对象分原生质体培养单倍体细胞培养按培养方式分悬浮细胞培养固定化细胞培养按培养基类型分固体培养液体培养固体培养优点：简便易行；

定义：包括利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养。

培养所占空间小。a.培养基中营养物质的浓度差导致愈伤组织生长不平衡b.气体交换不畅，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，堆积有害物质c.重力、光线，

细胞群体不均匀d.跟踪生理生化指标，需转入液体后，会改变组织的形态和生理状态缺点：固体培养常用的固化剂：琼脂（0.6%-1.0%）、藻酸盐、明胶（10%）、硅胶等培养温度为（25±1）℃光照以每天16h为宜，日光灯照射外植体在培养三周左右必须移换到新鲜培养基上，以保证培养物的继续生长液体培养a.小规模的悬浮培养b.植物细胞大规模培养成批培养半连续培养连续培养※（1）成批培养法

最适于植物细胞培养的生物反应器是：气升式反应器。培养过程用通气代替搅拌，避免了使用机械搅拌所致的细胞破碎、培养物易被污染、通气受限制等缺点，细胞产量也明显高于机械搅拌式生物反应器。※将培养基一次性地加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。次级代谢产物的积累往往发生在细胞生长的稳定期两步培养法：即使用两个生物反应器。第一个用于细胞生物量的积累；第二个用于次级代谢产物的生产。世界上第一个植物细胞工程商品---紫草宁（2）半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。可认为是具有定时进出装置的成批培养系统。总体积保持不变。（3）

连续培养法定义：在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。要维持系统的无菌状态，技术要求苛刻。※

二阶段连续培养法：第一罐中投入适于细胞增长的培养基，即生长培养基，并连续加入该培养基；第二罐中投入适于次级代谢产物产生的培养基，即生产培养基。采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中孔纤维膜等多种类型。优点：

a.细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体；

b.易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。

c.易于维持细胞间物理化学梯度；

d.有利于细胞组织化；（4）固定化培养法（了解）6.4小结（植物细胞培养的基本技术）植物材料的准备：灭菌培养基的组成：无机盐、碳源、氮源、植物生长素、维生素培养方法：成批培养法、半连续培养法、连续培养法思考题一、选择

1.植物组织培养过程中，获得外植体后，通常首先要进行灭菌，特别适用于草本植物和柔软组织的灭菌剂是——。A.次氯酸钙B.次氯酸钠C.氯化汞D.无水乙醇2.植物细胞培养基中常需要加入——维生素。A.A族B.B族C.C族D.D族4.植物细胞培养中有些研究必须在固体培养基上进行，最常用的固化剂是——。A.明胶B.淀粉C.琼脂D.硅胶5.最适合植物细胞培养的生物反应器是——。A.机械搅拌式B.气升式C.转鼓式D.鼓泡塔式6.植物细胞培养应用最广泛的培养基是——。A.MEM培养基B.DMEN培养基C.BME培养基D.MS培养基二、填空1.植物细胞培养的最适温度是——，光照以每天——为宜。2.日本科学家成功开发的第一个植物细胞工程商品是——。三、名词解释成批培养法连续培养法四、问答

植物细胞培养的培养基由哪些主要成分组成？植物细胞大规模培养的主要方法及其特点是什么？6.5影响植物次级代谢产物累积的因素①生物条件：外植体、季节、休眠、分化等；②物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（O2）、pH和渗透压等；③化学条件：无机盐、碳源、植物生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体等；④工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方法。影响因素：

6.5.1外植体的选择

不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。同一化合物可以在不同外植体的不同生长阶段中累积。表6-8：一些植物细胞次级代谢产物累积的时期。曼陀罗属、莨菪属托品类生物碱，延迟期紫草紫草宁，稳定期。（1）

培养环境的内在因素①接种和诱导：外植体大小、细胞密度及营养成分能显著次级代谢产物的产率。②基本培养基成分：物质基础6.5.2

培养条件的影响磷：低磷有利于次级代谢产物的累积，缺乏磷会导致细胞生物量的大幅度降低。氮：两种主要氮源，即NO3-和NH4+铜：邻二酚、对二酚、抗坏血酸氧化酶活性基团，是次级代谢产物累积的必要元素，还可作为非生物诱导子（紫草紫草宁）。Cu2+③碳源使用最多的碳源是糖类，其影响主要取决于所使用的糖类的种类、浓度及细胞次级代谢产物的生物合成过程。糖的作用：延长稳定期，蔗糖分解产物所产生的对内源性生长素合成的抑制作用，增强磷酸戊糖途径有关酶的活性。

⑤O2和pH

④植物生长调节剂

在植物细胞培养中起着关键性作用，必须通过仔细的实验观察才能确定其合适的数量和种类。O2

：维持其正常呼吸作用。悬浮细胞培养：通气和搅拌，速度120~160r/min固定化细胞培养：通气，含5%CO2的洁净空气pH：植物细胞生长最适pH在5~6之间，培养基应具有一定的缓冲性质。⑥渗出物初级代谢产物、次级代谢产物、某些酸性物质、醇类和水解蛋白或活性蛋白等。细胞分泌产物的量也取决于发育阶段。如多叶羽扁豆悬浮细胞培养中，在活跃的生长期初期，酶的分泌量就达到了稳定期的水平。第一步使用适合细胞生长的培养基（生长培养基），营养丰富----使用肌醇、维生素类成分，使用生长素刺激细胞生长。第二步使用适合次级代谢产物合成的培养基（生产培养基）----具有低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或少量的碳源，加入细胞分裂素便于次级代谢产物的产生。※（2）

两步培养法表6-12植物抗毒素：在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物。如豌豆产生的豌豆素、大豆的菜豆蛋白等。植物抗毒素不能在健康的正常的组织（有微量存在）中产生，只有细胞受刺激时才能产生或产量增加。诱导子：触发形成植物抗毒素信号的物质。包括侵染植物的微生物、植物细胞内的分子、光、外部的培养条件等。诱导子的分类和作用机制详见6.7.1……（3）

诱导子（4）培养环境的外部因素①温度：次级代谢产物产生的最佳温度为20-28℃

②搅拌频率：直接影响发酵液中的溶氧浓度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力。

③培养容器的影响：容器的大小和搅拌装置的不同会产生不同的次级代谢产物。

④光的影响：光照时间、光强、光质能影响植物培养细胞的次级代谢产物，如：黄酮，挥发油。6.5小结（影响植物次级代谢产物累积的因素）外植体的选择培养环境的内在因素：接种和诱导、基本培养的成分、碳源、植物生长调节剂、渗出物两步培养法培养环境的外部因素：温度、搅拌频率、培养容器的影响、光的影响思考题一、名词解释

两步培养法二、填空

1.植物细胞培养中使用最多的碳源是——。2.植物细胞生长最适温度为——，最适pH为——。3.光照是植物培养的一个重要影响因素，——、——、——对次级代谢产物的累积都有一定的影响。三、问答

影响植物细胞次级代谢产物累积的因素有哪些？6.6植物细胞培养的生物反应器反应器的选择取决于生产细胞的密度、通气量以及所提供的营养成分的分散程度。根据通气和搅拌系统的类型，生物反应器可分为：

①摇瓶②搅拌型生物反应器③环流生物反应器和鼓泡塔生物反应器摇瓶：气体和营养成分的均匀分布可以通过机械的简单振荡而达到搅拌的目的。搅拌型生物反应器：可运用各种搅拌器，有利于培养物的高度混合；但是高耗能，严重损伤植物细胞。图6-3b环流生物反应器和鼓泡塔生物反应器：依靠外部循环泵或压缩空气的流动来完成培养基混合，压缩空气也成为氧气的供应来源。图6-3c,d6.6.1机械搅拌式生物反应器6.6.2鼓泡塔生物反应器6.6.3气升式生物反应器6.6.4转鼓式生物反应器6.6.5固定化细胞生物反应器植物细胞大规模培养生物反应器的类型：通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的。优点：易控制温度、pH、溶氧及营养物质浓度，混合均匀。搅拌装置要减少剪切力，一般改叶轮式为螺旋式。6.6.1

机械搅拌式生物反应器（图6-3b）加液装置——随时补充水分和营养；通气装置——通入新鲜空气，排出有害气体；取样口——为便于取样观察。图6-4

※螺旋式叶轮式6.6.2鼓泡塔生物反应器优点：没有运动部件，适于对剪切敏感的细胞的培养，不易染菌，相对高的热量和质量传递，放大相对容易。缺点：流体流动形式难以确定，混合不匀。通空气，经反应器底部的喷嘴及多孔板实现气体流动，从而完成反应物的混合。图6-3d6.6.3气升式生物反应器（图6-3d）考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的轴封处容易泄漏造成污染。因此，发展出空气提升式生物反应器，它是最适合培养植物细胞的反应器之一。原理：利用罐底的气体分布器将气体导入反应器内部的导流管，使导流管内的液体密度低于外部区域，从而形成循环。※

气升式生物反应器优点：罐内液体流动温和均匀，产生的剪切力小，由于罐内没有机械搅拌装置，因而对细胞损伤较小；可直接喷射空气供氧，因而氧传递速率高；液体循环量大，细胞和养分均能均匀分布于培养液中；此外结构简单，利于密封并降低了成本。缺点：高密度培养时混合不均匀。6.6.4转鼓式生物反应器

通过转动促进反应器内氧及营养物的混合，设置挡板有助于提高氧的传递。优点：在高密度培养时有高的传氧能力。缺点：难于大规模操作，放大困难。6.6.5固定化细胞生物反应器固定化细胞：指固定在载体（尼龙网套、纤维膜）上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。先决条件：细胞的代谢产物必须分泌到细胞外优点：可保护细胞免受剪切力产物随培养基带走,固定化细胞可长时间重复使用，细胞间接触良好，有利于次级代谢产物的合成易于实现细胞的高密度培养减少细胞的遗传不稳定性易于实现连续化操作6.6.6各种植物生物反应器的性能比较不同类型的生物反应器各有其优缺点，而改进的搅拌式生物反应器和气升式反应器可能更适合植物细胞的培养。悬浮培养细胞干重＜20g/L以气升式生物反应器为好，细胞干重＞20g/L以改进的机械搅拌式生物反应器为好。讨论各种植物细胞培养的生物反应器的主要特点是什么？6.7植物细胞制药的进展与展望6.7.1诱导子在植物细胞工程研究中的应用6.7.2前体饲喂6.7.3

两相法培养6.7.4

转基因技术在次级代谢产物生产中的应用6.7.5

植物生物转化技术与生物制药诱导子：是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应（抗性反应、自身防御反应）的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。诱导子能快速、高度专一性的诱导植物细胞特定基因的表达。利用诱导子进行有目的的次生代谢产物合成，成为大幅度提高培养物中代谢产物含量的重要方法之一。6.7.1诱导子在植物细胞工程研究中的应用生物诱导子：植物在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，包括：分生孢子、降解细胞壁的酶类、有机体的细胞壁碎片、有机体产生的代谢物以及培养物滤液中的成分。非生物诱导子：不是植物细胞中天然成分但又能触发形成植物抗毒素信号的因子，如β-庚糖苷、光、外部培养条件。根据诱导子的来源分为：根据诱导子在细胞内或细胞外形成分为：细胞内源性诱导子：来自植物细胞的分子，多为植物细胞壁在微生物作用下的降解产物及沉积在细胞壁上的木质素。细胞外源性诱导子：又称真诱导子，病原微生物在入侵植物时自身被降解的产物及其代谢产物。真菌诱导子分4类结构：多糖类（壳聚糖，木质素类）；糖蛋白类（α-糖蛋白，β-糖蛋白）；蛋白质类（酶类）；不饱和脂肪酸类（花生四烯酸）

膜脂超氧化和膜结构功能的改变，使膜的通透性增加，流动性改变形成和积累抗微生物的低相对分子质量植保素蛋白酶抑制物的积累可抑制病原微生物在侵染植物过程中分泌裂解植物细胞壁的蛋白酶合成和分泌降解微生物细胞壁的酶，从而抑制微生物生长诱导子的作用机制：6.7.2

前体饲喂

在药用植物组织培养中，通过加入次生代谢物合成的前体物质来提高细胞中有效组分的含量。

次生代谢物的形成主要依赖于3种结构单位的供应：

莽草酸：芳香类化合物的前体

氨基酸：生物碱及肽类的前体

乙酸：多酚类，类异戊二烯，大环抗